ЖУРНАЛ АНАЛИТИЧЕСКОЙ ХИМИИ, 2007, том 62, № 10, с. 1078-1085
^=ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ =
УДК 543.9:621.3.082 73:57.083.3
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИТЕЛ К БАКТЕРИЯМ YERSINIA ENTEROCOLITICA С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПЬЕЗОКВАРЦЕВОГО ИММУНОСЕНСОРА
© 2007 г. Е. Н. Калмыкова*, Е. С. Дергунова*, Н. Ю. Зубова**, Р. П. Горшкова*,
Н. А. Командрова***, Т. Н. Ермолаева*
*Липецкий государственный технический университет
398600Липецк,ул. Московская, 30 **Центр гигиены и эпидемиологии Липецкой области 398001 Липецк, ул. Октябрьская, 80 А ***Тихоокеанский Институт биоорганической химии ДВО Российской академии наук 69002 Владивосток-22, просп. 100-летия Владивостока, 159 Поступила в редакцию 21.06.2006 г., после доработки 07.03.2007 г.
Предложен гравиметрический способ определения антител к бактериям Yersinia enterocolitica серо-вара О : 3 с использованием пьезокварцевого иммуносенсора на основе иммобилизованных липопо-лисахаридов. Оптимизированы условия и разработана методика проточно-инжекционного анализа образцов сыворотки крови с использованием иммуносенсора в качестве детектора: предел обнаружения антител составляет 1.3 мкг/мл; sr 0.08; диапазон определяемых концентраций - 3-100 мкг/мл. Преимуществами предлагаемого способа являются экспрессность (продолжительность анализа не более 10 мин) и возможность прямой регистрации образующегося агглютината без дополнительного введения меток.
Иерсиниоз - острое инфекционное кишечное заболевание, широко распространенное во всем мире, передающееся через зараженную воду, овощи, фрукты, мясные и молочные продукты, в том числе, хранящиеся в холодильнике. Возбудителями болезни являются микроорганизмы Yersinia enterocolitica, включающие более 50 различных серологических вариантов, которые относят к инфекциям, способным вызывать эпидемические вспышки. Наибольшее значение в патологии человека имеют серовары О : 3; О : 5; О : 6; О : 8 и О : 9. Характерной особенностью инфекции является полиморфизм клинических проявлений (кишечная, артритная, миокардитная и др. формы), затрудняющий распознавание болезни, поэтому ранние лабораторные исследования играют решающую роль в постановке правильного диагноза, проведении эффективного лечения и предотвращении эпидемий.
Для лабораторной диагностики в настоящее время наряду с бактериологическими, достаточно широко используют серологические методы - реакции преципитации (РП), непрямой, или пассивной гемагглютинации (РПГА), иммунофермент-ный анализ (ИФА), основанные на использовании в качестве антигенов не только живых и убитых бактерий, но и отдельных компонентов внешней мембраны клеточной стенки грамотри-цательных бактерий - липополисахаридов (ЛПС)
[1-3]. Недостатками серологических методов являются низкая чувствительность вследствие субъективной визуальной оценки результатов, длительность процедуры анализа, либо необходимость введения метки (ферментной, радиоактивной, флуоресцентной и др.).
Принципиально новые возможности высокочувствительной и экспрессной регистрации имму-нохимических взаимодействий без введения меток открывает применение пьезокварцевых иммуно-сенсоров, действующих по принципу микровесов. Теоретические основы и возможности практического использования иммуносенсоров рассмотрены в ряде обзорных публикаций [4-6].
За рубежом активно проводятся исследования по созданию пьезоиммуносенсоров для клинической медицины и ветеринарии [3, 5]. В нашей стране изучение гравиметрических иммуносенсоров началось сравнительно недавно [7-10].
Цель работы - исследование иммунохимиче-ских реакций на поверхности электродов пьезокварцевых резонаторов с биорецепторным слоем на основе иммобилизованных ЛПС серовара О : 3 (штамм 81) для создания высокочувствительного и селективного пьезоиммуносенсора, предназначенного для определения антител к бактериям У. еМегосоШка О : 3 в образцах сывороток крови.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Реагенты. В работе использовали хлорид, гидрофосфат и азид натрия; хлорид, дигидрофосфат и тиоцианат калия; соляную кислоту, тиомочевину, пептон, сульфат аммония и магния, хлорид меди и железа, глюкозу и серный эфир, хлороформ (ч.д.а.,
Россия), кедровое масло (nD = 1.477; d = 0.927), используемое в иммерсионной микроскопии (Россия).
Буферный фосфатный физиологический раствор 0.01 M (PBS) с рН 5.8; 7.2; 8.0 готовили на основе бидистиллированной воды.
Исходные 0.1% растворы ЛПС получали растворением навесок сухого образца (1 мг) в 1 мл PBS, рН 7.2 и разбавлением до требуемой концентрации.
Наработка микробной массы. Для изучения были выбраны культуры микроорганизмов S-форм Y. enterocolitica различных штаммов: музейных - из коллекции Парижского Международного центра по иерсиниям (К) и выделенных от больных (Б) в Приморском крае серовары: О : 3 -штамм 81 (Б), О : 5 - штаммы 97 (Б), 572 (Б), 124(К); О : 5.27 - штамм 885 (К); О : 6.30 - штамм 102 (К); О : 6.31 - штаммы 1477 (К) и 597 (Б), предоставленных Владивостокским научно-исследовательским институтом микробиологии и эпидемиологии. Микробную массу получали в соответствии с методикой, опубликованной ранее [11]. Выход сухого ацетонового порошка микробной массы составлял в среднем 1.0 г на 1 л синтетической среды.
Выделение и очистка ЛПС. Сухой ацетоновый порошок микробных клеток О : 3 (штамм 81) обрабатывали 45%-ным водным раствором фенола по методу Вестфаля [12]. Примесные белки водного слоя удаляли экстракцией серным эфиром. Нуклеиновые кислоты осаждали трехкратным центрифугированием при 105000х g в течение 3 ч. Полученный осадок, содержащий ЛПС, очищали от низкомолекулярных примесей диализом против дистиллированной воды и лиофилизовали. Выход сухих ЛПС составляет 1-2% от сухой микробной массы.
Сыворотки против бактерий Y. enterocolitica.
Сыворотки, содержащие поликлональные антитела, сероваров О : 3 (штамм 81); О : 5 (штамм 124); О : 5.27 (штамм 885); О : 6.30 (штамм 102) и О : 6.31 (штамм 597), получены иммунизацией кроликов взвесью микробных клеток по методике [13] и лиофильно высушены. Диагностическая стандартная сыворотка О : 3 (титр активности 1 : 6400) взята из набора РПГА сухого эритроцитарного биодиагностикума; сыворотки от больных (№ 3218, 3467, 4465, 4618, 4765, 4766, 4767, 4919,
5483, 5485, 5488, 5472 и 5499) предоставлены Центром гигиены и эпидемиологии Липецкой области.
Иммобилизация ЛПС. Использовали пьезоквар-цевые резонаторы АТ-среза (10 МГц ± 1 Гц) с серебряными электродами диаметром 5 мм, полученными магнетронным напылением серебра (ОАО "Квант", ЗАО "ЭТНА", Россия). На поверхность чистых сухих электродов наносили 1 мкл раствора кедрового масла в хлороформе (0.01%). После испарения растворителя на полученные пленки вносили 5 мкл водного раствора ЛПС (0.01%) и помещали во влажную камеру на 12 ч при +4°C или 3-4 ч при 20°C. Затем резонаторы выдерживали 1 ч в PBS, промывали бидистиллированной водой и высушивали на воздухе [14].
Пробоподготовка сывороток крови. Использовали образцы растворов, приготовленных соответствующим разбавлением исходных 0.1% растворов сухих лиофилизованных кроличьих сывороток в PBS.
Для реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) пробы готовили в соответствии с прилагаемой к диагностикуму методикой последовательным разбавлением исходных сывороток (1 : 25) в 2 раза до получения итогового разведения 1 : 12800.
Нативные сыворотки крови людей разбавляли PBS 1 : 25, затем к 20 мкл полученного раствора добавляли 780 мкл PBS, получая таким образом итоговое разведение 1 : 1000, и исследовали с помощью пьезокварцевого иммуносенсора.
Исследование иммунохимических реакций иммобилизованных ЛПС с антителами или неспецифическими белками (BSA, OVA), содержащимися в анализируемых растворах, проводили при комнатной температуре в проточно-инжекционном режиме с пьезокварцевым иммуносенсором в качестве детектора [8, 14]. Лабораторная установка включала проточную микроячейку детектирования (15-20 мкл), обеспечивающую контакт одной стороны закрепленного в ней сенсора с анализируемым раствором; перистальтический насос, регулирующий скорость потока раствора-носителя -PBS (30-90 мкл/мин); генератор возбуждения колебаний резонатора на базе элементов транзисторно-транзисторной логики (ТТЛ) и частотомер ЧЗ-54 (Россия), регистрирующий изменение частоты колебаний сенсора. Все узлы установки соединены силиконовыми шлангами, с внутренним диаметром 0.5 мм.
Один измерительный цикл продолжительностью 10 мин обычно включает несколько стадий [10]: пропускание буферного раствора-носителя перед началом измерений для стабилизация базовой линии (fm); ввод анализируемой пробы, вызывающий снижение частоты колебаний сенсора (Af=fm - f ); введение буферного раствора для ста-
Антитело
Углеводная область
ЛПС<
V
Липидная область
Vi^:
одооопоО
Электрод
Масло
Рис. 1. Взаимодействие антител с ЛПС, иммобилизованными на гидрофобной подложке.
билизации аналитического сигнала и удаления не связавшихся молекул аналита; пропускание регенерирующего раствора, вызывающего диссоциацию иммунного комплекса на поверхности электрода сенсора и восстановление частоты его колебаний (/т). Фиксирование относительного изменения аналитического сигнала (А/) нивелирует влияние неспецифических взаимодействий и существенно повышает воспроизводимость измерений.
Биослой регенерировали 0.3-0.5 М КС№. Полное очищение металлической поверхности от ли-пидного слоя осуществляли простой обработкой электродов хлороформом, не разрушающим металл, после чего резонатор может использоваться для иммобилизации других ЛПС более 5-7 раз.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Известно, что эффективность и стабильность работы пьезокварцевых иммуносенсоров в значительной степени определяется качеством биоре-цепторного покрытия, которое зависит от природы используемых биомолекул и способа формирования биослоя [6], поэтому большое внимание было уделено исследованию условий иммобилизации ЛПС на поверхности электродов сенсора.
Иммобилизация иммунореагентов. Основными требованиями, предъявляемыми к качеству биорецепторного слоя, являются прочность за-
крепления на поверхности электрода сенсора, сохранение высокой активности иммобилизованных молекул, физ
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.