ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 543.54,543.51
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДИГИДРОКСИМЕЛФАЛАНА В ПЕРФУЗАТЕ,
ПЛАЗМЕ КРОВИ И ТКАНИ ЛЕГКОГО МЕТОДОМ ВЭЖХ С МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИМ ДЕТЕКТИРОВАНИЕМ. ПРИМЕНЕНИЕ К ФАРМАКОКИНЕТИЧЕСКОМУ ИССЛЕДОВАНИЮ © 2014 г. А. А. Сидорова*, А. В. Григорьев*, Е. С. Тимофеева**, Е. В. Левченко**
*Санкт-Петербургский государственный политехнический университет ЦКП "Аналитическая спектрометрия"
195220 Санкт-Петербург, ул. Гжатская, 27, а/я 27 **ФГУ "Научно-исследовательский институт онкологии им. Петрова Росмедтехнологий" 197758Санкт-Петербург, Песочный-2, ул. Ленинградская, 68 Поступила в редакцию 07.11.2012 г., после доработки 11.09.2013 г.
Разработана экспрессная, чувствительная и специфичная методика определения дигидроксимел-фалана (ДГМ) в биологических объектах методом ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектированием. Пробоподготовка плазмы крови, перфузата и ткани легкого включает стадии гидролиза, гомогенизации (для ткани) и осаждения белков. Степень экстракции ДГМ (п = 5) составила 91.2 ± 4.0, 89.5 ± 2.7 и 75.9 ± 3.8% для перфузионного раствора, плазмы крови и ткани легкого соответственно. Предел детектирования ДГМ 1.0 нг/мл в перфузате и плазме крови, и 2.0 нг/мл в ткани. Методика применена для исследования фармакокинетики противоопухолевого препарата Алкеран после ин-траоперационной изолированной химиоперфузии легкого.
Ключевые слова: ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектированием, дигидроксимелфалан, пер-фузат, плазма крови, ткань легкого, ретроспективный анализ, пробоподготовка, фармакокинетика.
БОТ: 10.7868/80044450214040100
Противоопухолевый препарат Алкеран®, в котором действующим веществом является мелфа-лан (производное хлорэтиламина), используют для лечения множественной миеломы, нейробла-стомы, саркомы мягких тканей конечностей, рака толстой и прямой кишки и рака легких [1—4]. Для снижения системной токсичности мелфала-на проводят местную перфузию конечностей при множественной миеломе [5—7]. Разработан высокоэффективный метод лечения метастатического поражения легких с использованием мелфалана [8, 9]. Для улучшения результатов лечения предложено сочетание хирургического подхода [10—14] с методикой изолированной химиоперфузии легкого (ИХПЛ), в процессе которой происходит доставка высоких доз противоопухолевых препаратов в ткани легкого при их минимальной системной концентрации [8, 9, 15, 16].
Для определения эффективности проникновения лекарственного вещества в раковые клетки и ткани и оценки системной токсичности ИХПЛ необходим чувствительный и селективный метод определения мелфалана. Описаны различные методики определения мелфалана в биологических
матрицах методом обращенно-фазовой ВЭЖХ с флуоресцентным [5, 17, 18], спектрофотометри-ческим [6, 19—22], электрохимическим [23, 24] и масс-спектрометрическим детектированием [5, 25-27].
Основными сложностями определения мел-фалана являются его низкие терапевтические концентрации и склонность к спонтанному гидролизу с образованием нестабильного моногид-роксимелфалана и конечного более стабильного продукта — дигидроксимелфалана (ДГМ) [5, 25] (рис. 1). Скорость гидролиза зависит от рН, концентрации белков и хлорид-ионов в растворе и от температуры, поэтому практически все описанные методики требуют проведения пробоподготовки либо в бане со льдом, либо при температуре —20°С [5, 17—25], что значительно усложняет анализ и увеличивает его стоимость.
Для проведения фармакокинетического исследования процедуры ИХПЛ необходима методика с возможностью ретроспективного анализа, т.к. процедура проводится редко и при температуре 37°С. Способность мелфалана гидролизовать-ся в этих условиях требует разработки корректной
Cl Cl OH
г1 г1 г1
NNN.
^^ OH
O O O
Мелфалан Моногидроксимелфалан Дигидроксимелфалан
Рис. 1. Структурные формулы аналитов.
пробоподготовки образцов плазмы крови и ткани легкого.
Цель данного исследования — разработка чувствительной, селективной и надежной хромато-масс-спектрометрической (ВЭЖХ-МС) методики для исследования фармакокинетического профиля мелфалана в образцах перфузионных растворов, плазмы крови и ткани легкого после процедуры ИХПЛ.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Реагенты и материалы. Использовали мелфалан (Sigma, Германия) и Алкеран® (GlaxoSmithKline Manufacturing S.p.A., Италия). Дигидроксимелфалан готовили из водного раствора мелфалана путем полного гидролиза при температуре 60°C в течение 4 ч в соответствии с литературными данными [12, 17, 21] и хранили при температуре —80°C. Для приготовления подвижной фазы и проведения пробоподготовки использовали аце-тонитрил и метанол для ВЭЖХ (Merck), уксусную кислоту и аммиак для ВЭЖХ-МС (Sigma). Образцы плазмы крови с консервантом К2ЭДТА, пер-фузионных растворов и ткани легкого предоставлены НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова. Ультрачистую воду получали с помощью станции очистки воды Milli-Q Synthesis Station (Millipore, США).
Таблица 1. Уровни концентрации (нг/мл) ДГМ в образцах контроля качества (1—Ш)
Биологическая матрица I II III
Перфузат 3.0 500.0 1400.0
Плазма 3.0 250.0 500.0
Ткань легкого 6.0 250.0 500.0
Аппаратура. Использовали хромато-масс-спектрометр Agilent 1100, оснащенный изократи-ческим насосом, автоматическим дозатором, термостатом и квадрупольным масс-спектрометром с электрораспылительной ионизацией (G1946C). Разделение проводили на колонке (150 мм х 2.0 мм) REPROSIL-PUR C18-AQ (3 мкм) с предколонкой (10 мм х 2.1 мм) YMC-Pack ODS-AQ (3 мкм) при температуре 25°С, используя подвижную фазу ацетонитрил—вода—уксусная кислота 10 : 90 : 0.01 (по объему) при расходе 0.15 мл/мин. Объем ввода пробы 5 мкл.
Условия электрораспылительной ионизации: скорость потока, температура и давление осушающего газа 10 л/мин, 330°С и 40 psig соответственно; напряжение на капилляре и фрагменто-ре 3 кВ и 100 В соответственно. Полученные ионы детектировали в условиях мониторинга выбранного иона [M + H]+ с m/z 269.
Для термостатирования образцов использовали термостат BIOSAN CH-100 с функцией нагрева и охлаждения (—10...100°С), для выпаривания образцов в процессе пробоподготовки — систему Tur-boVap LV (Calliper).
Приготовление стандартных растворов. Стандартный раствор мелфалана готовили в метаноле и хранили при температуре —80°C. Рабочие растворы мелфалана с концентрацией 100 и 10 мкг/мл готовили путем разбавления стандартного раствора метанолом и хранили при —25°C.
Растворы, используемые для построения гра-дуировочных графиков при анализе перфузата, плазмы крови и ткани легкого, готовили ежедневно путем добавления рабочих растворов мелфалана в соответствующий объем биологической матрицы, не содержащей раствор лекарства. Образцы с известной введенной концентрацией определяемого вещества в дальнейшем подвергали процедуре пробоподготовки, описанной ниже, для получения серии растворов с содержанием ДГМ 1— 1400 нг/мл (для перфузата), 1—500 нг/мл (для плазмы) и 2—500 нг/мл (для ткани легкого).
Образцы контроля качества готовили для трех уровней концентраций ДГМ (табл. 1): трехкратный нижний уровень количественного определения (I), средний уровень (II) и верхний уровень концентраций (III).
Процедура перфузии легкого препаратом Алке-ран®. Химиоперфузию проводили при температуре раствора 37°C в течение 40 мин [8]. Для приготовления перфузионного раствора одну дозу Алкерана® (50 мг) растворяли в 1000 мл физиологического раствора с добавкой 2 мл гепарина. Окончательная концентрация мелфалана в перфузионном растворе составила 49.4 мкг/мл.
Пробоподготовка перфузионного раствора. К
аликвоте 50 мкл перфузата добавляли 1950 мкл воды, перемешивали, выдерживали в термостате в течение 4 ч при 60°C для проведения гидролиза. Из полученного раствора отбирали 200 мкл надоса-дочной жидкости для анализа методом ВЭЖХ-МС.
Пробоподготовка образцов плазмы крови состояла из гидролиза и осаждения белков ацетонитри-лом. К аликвоте 200 мкл плазмы крови добавляли 200 мкл воды, смесь термостатировали 4 ч при 60°C, осаждали белки трехкратным объемом аце-тонитрила, центрифугировали в течение 10 мин при 8000 об/мин. Надосадочную жидкость отделяли, выпаривали досуха в токе азота при 40°C, остаток растворяли в 200 мкл воды и анализировали.
Пробоподготовка ткани легкого. Образец ткани массой 200—300 мг гомогенизировали в 2 мл 50%-ного раствора метанола в воде. Гомогенат гидроли-зовали при 60°C в течение 4 ч, центрифугировали, отбирали надосадочную жидкость, выпаривали досуха и растворяли, как описано выше для плазмы.
Проверка достоверности методики. Точность (среднеквадратичное отклонение) и достоверность (близость среднего значения к истинному) метода в одной аналитической серии и между сериями оценивали путем анализа образцов контроля качества (n = 5). Нижнюю границу определяемых концентраций (сН) оценивали в биологических матрицах, меченных ДГМ. Степень экстракции ДГМ определяли при трех уровнях концентраций путем сравнения подготовленных образцов и образцов с добавками ДГМ в подготовленную матрицу. Стабильность определения ДГМ в плазме крови, перфузате и ткани оценивали после хранения образцов контроля качества при —80°C в течение 6 мес. Стабильность подготовленных образцов оценивали при комнатной температуре в течение 14 ч. Полученные результаты сравнивали с данными для свежеприготовленных образцов контроля качества и вычисляли стандартное отклонение.
Применение для клинических исследований.
Определение ДГМ выполняли в клинических об-
разцах, полученных от 18 пациентов после процедуры ИХПЛ. Метод ИХПЛ был одобрен Этическим комитетом НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова. Забор образцов осуществляли в течение полугода. Образцы периферической крови отбирали через 5, 15, 30 и 60 мин (во время процедуры перфузии) и через 12 и 24 ч после процедуры. Образцы перфузата отбирали через 5, 15 и 30 мин. После проведения ИХПЛ брали образцы ткани легкого и метастатической опухоли объемом 1 см3. Образцы крови немедленно центрифугировали, плазму крови, перфузат и ткань легкого замораживали при —80°C до анализа.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Стабильность мелфалана в условиях проведения ИХПЛ исследовали путем инкубирования перфузион
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.