ЖУРНАЛ АНАЛИТИЧЕСКОЙ ХИМИИ, 2007, том 62, № 8, с. 797-801
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 543.544
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭНДО- И ЭКЗОГЕННЫХ КОРТИКОСТЕРОИДОВ ЦИКЛОДЕКСТРИН-МОДИФИЦИРОВАННОЙ МИЦЕЛЛЯРНОЙ ЭЛЕКТРОКИНЕТИЧЕСКОЙ ХРОМАТОГРАФИЕЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ON-LINE КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ
© 2007 г. Л. А. Карпова, Е. Г. Стрельникова
Санкт-Петербургский государственный университет, химический факультет 198904 Санкт-Петербург, Петродворец, Университетский просп., 2 Поступила в редакцию 14.03.2006 г., после доработки 25.05.2006 г.
Предложена методика одновременного определения стероидов эндо- и экзогенного происхождения с использованием мицеллярной электрокинетической хроматографии, позволяющая обнаруживать остаточные лекарственные препараты в биологических жидкостях и контролировать эффективность лекарственной терапии при различных нарушениях стероидогенеза. Введение макроцикличе-ской (от 1 до 6 Мм) добавки - Р-циклодекстрина в буферный электролит (25 мМ фосфорной кислоты, 20 мМ ДДСН, 4.5 мМ мочевины, рН 2.5) или в раствор пробы позволяет снизить предел обнаружения в 20-200 раз.
В последние десять лет одним из наиболее широко развивающихся направлений в анализе органических веществ является применение цикло-декстринов (ЦД) и его производных в качестве компонентов подвижных и неподвижных фаз в ВЭЖХ [1-7].
Циклодекстрины - первые макроциклы, для которых была обнаружена и детально исследова-
на способность к образованию комплексов включения с органическими молекулами. Необычные свойства в-циклодекстрина (Р-ЦД) (рис. 1) определяются его уникальной структурой: он имеет форму усеченного конуса, внутренняя полость которого гидрофобна. Расположенные вне этой полости гидроксильные группы обеспечивают гидрофильные взаимодействия с определяемыми веществами.
Рис. 1. Структура Р-циклодекстрина. 797
Рис. 2. Структура углеродного скелета стероидных
гормонов.
Первая работа по изучению взаимодействия стероидов с различными циклодекстринами была опубликована в 1982 г. [5]. Было показано, что более прочные комплексы ЦД образуют с более гидрофобными стероидами, причем комплексообра-зование происходит главным образом по циклам A и B молекулы стероида (рис. 2).
Liu и сотр. [5] описали комплексообразование в системе ЦД-стероидный гормон, где на одну молекулу стероида приходится две - комплексо-образователя.
Это происходит, когда концентрация макроцикла по отношению к стероиду достаточно высока. Было высказано предположение, что в данном случае циклы стероида C и D включаются в полость одной молекулы в-циклодекстрина, а циклы А и В - в полость другой молекулы.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Стандартные растворы кортизола, кортизона, кортикостерона, тестостерона, 11-дезоксикорти-костерона, (фирма "Sigma", США) с концентрацией 1 мг/мл готовили растворением навесок по 1 мг каждого из стероидов в 1 мл ацетонитрила во фторопластовых пробирках. Стандартные растворы лекарственных препаратов (декартин-Н, кортизон-ацетат, кортинефф) готовили растворением навесок, взятых из таблеток. Концентрация действующего вещества - 1 мг/мл. Дексаме-тазон использовали в виде суспензии (глазные капли) с концентрацией 1 мг/мл. Рабочие растворы готовили разбавлением стандартных растворов в необходимое число раз (до концентрации 10 и 1 мкг/мл) с помощью микрошприца и автоматического дозатора. Полученные растворы до анализа хранили в морозильной камере при -20°С. В качестве буферного электролита (БЭ) применяли 25 мМ раствор фосфорной кислоты (рН 2.5) с 20 мМ ДДСН и 4.5 мМ мочевины, а также такой же буферный электролит с добавлением 1.0; 2.0; 3.0; 4.0; 6.0 мМ в-ЦД. При приготовлении буферных электролитов, содержащих макроцикл, в исходные растворы вводили определенные навески в-ЦД для получения заданной концентрации. Ввод пробы гидродинамический, 60 мбар.
Электрофоретический анализ выполняли на системе капиллярного электрофореза "КАПЕЛЬ 103Р" с фотометрическим детектором (^макс = = 254 нм) (ООО "Люмэкс"). Условия капиллярного электрофореза: рабочее напряжение: - 25 кВ, ток: 96.3 мкА.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Метод мицеллярной электрокинетической хроматографии (МЭКХ) впервые был предложен Терабе в 1984 г. [8]. В отличие от зонного капиллярного электрофореза он позволяет разделять нейтральные и ионные вещества. В буферный электролит вводится поверхностно-активное вещество (ПАВ) - додецилсульфат натрия в концентрации выше критической концентрации ми-целлообразования (8.3 мМ), что повышает селективность разделения. Мицеллы выполняют роль "псевдостационарной фазы", и определяемые вещества распределяются между мицеллой и буферным электролитом. Додецилсульфат натрия (ДДСН) - наиболее широко используемый детергент, образующий мицеллы при капиллярном электрофорезе для разделения нейтральных соединений в присутствии ЦД. Метод, называемый циклодекстрин-модифицированная мицеллярная электрокинетическая хроматография (ЦД-МЭКХ), впервые предложен Терабе и сотр. в 1990 г. для разделения гидрофобных соединений [9].
Органические растворители (метанол, ацето-нитрил, изопропиловый спирт и т.д.), которые вводят в буферный раствор в концентрации до 30% объемных долей, с одной стороны, повышают растворимость определяемых веществ, делая пригодным метод капиллярного электрофореза для анализа соединений с ограниченной растворимостью в водных средах, а с другой стороны -уменьшают гидрофобные взаимодействия между определяемым веществом и мицеллой. Кроме того, органические модификаторы влияют на скорость электроосмотического потока (ЭОП) и электрофоретическую подвижность определяемых веществ [10-12].
В настоящей работе изучено влияние макро-циклической добавки (в-ЦД) на электрофорети-ческое разделение эндо- и экзогенных стероидных гормонов коры надпочечников.
Анализ осуществляли в режиме обращенной полярности (ввод пробы с катодного конца капилляра) методом МЭКХ при низких рН. Скорость электроосмотического потока в этих условиях очень мала. Для образования мицелл использовали раствор додецилсульфата натрия (20 мМ).
Анализируемые вещества, распределяясь между раствором буферного электролита и псевдостационарной фазой (мицеллы ДДСН), движутся против ЭОП по направлению к аноду. При добав-
ц, (смл2/кВ*, с) -0.23 г
-0.28,
-0.33
-0.38 -
-0.43 -
-0.48
-♦— 11-дезоксикортикостерон -А-- кортизон ацетат
кортинефф -■— кортизон
4 5 6
[Р-циклодекстрин] мМ дексаметазон кортикостерон преднизолон кортизол
Рис. 3. Зависимость электрофоретических подвижностей цобщ стероидов от концентрации Р-циклодекстрина.
лении в-ЦД в рабочий электролит электрофоре-тические характеристики стероидов меняются, что позволяет достичь полного разделения всех компонентов смеси. Происходит перераспределение определяемых веществ не только между раствором буферного электролита и мицеллами, но также и молекулами в-ЦД.
Различие в структуре разделяемых веществ определяет характер взаимодействия в системе макроцикл-субстрат.
Показано, что добавка макроциклического агента в наибольшей степени способствует увеличению разделения кортизона и преднизолона.
При увеличении содержания в-ЦД в буферном электролите, электрофоретические подвижности разделяемых веществ (|общ) сначала уменьшаются (электрофорез осуществляется при обращенной полярности, поэтому |общ даны с отрицательным знаком), а затем постепенно возрастают (рис. 3). Это можно объяснить следующим образом: образующиеся уже при малых концентрациях макроцикла комплексы "стероид-циклодекс-трин" являются более гидрофобными, чем свободные стероиды. При последующем увеличении концентрации в-ЦД (>2 мМ) возрастает вязкость рабочего электролита, что, и приводит к уменьшению электрофоретической подвижности аналитов.
Общую электрофоретическую подвижность компонентов рассчитывали по формуле (1):
Цобщ
_ Lэфф^общ
Ut
(1)
мигр
где L^ - общая длина капилляра (от входного до выходного конца), см; L^ - эффективная длина капилляра (от входного конца до детектора), см; U - величина рабочего напряжения, В; ?мигр - время миграции компонента, с.
Стероидные гормоны в биологических объектах содержатся на уровне концентраций порядка микрограмм в литре. Поэтому для увеличения чувствительности анализа обычно их предварительно концентрируют методами твердофазной или жидкостно-жидкостной экстракции.
Следует отметить, что при электрофоретиче-ском анализе реальных биологических объектов даже использование такого концентрирования не всегда обеспечивает требуемый предел обнаружения стероидов. Описаны различные варианты концентрирования непосредственно в кварцевом капилляре, которые можно подразделить на четыре основные группы: стэкинг (stacking), динамический рН-скачок, изотахофорез и свипинг (sweeping) [13-15]. В основе каждого из этих методов лежит определенный механизм концентрирования (хроматографический или электрофоре-
А
В
С
D
УФ
БЭ
ДДСН-
Ог
Ог
шжжт Ж V
Рис. 4. Схема свипинга: ЕЗ Анионные мицеллы в БЭ Ш Зона разделенных определяемых соединений Нейтральные анализируемые вещества в зоне образца
тический), обусловленный различием свойств раствора пробы и ведущего электролита, таких как электропроводность, концентрация добавки и рН буфера.
Свипинг - метод концентрирования разделяемых веществ в МЭКХ непосредственно в процессе анализа предложен в 1998 г. [14]. В основе его лежит концентрирование веществ в псевдостационарной фазе (мицеллах), которые проникают в зону образца, не содержащую мицелл. При этом проводимость раствора, содержащего образец, близка к проводимости рабочего электролита, а ЭОП фактически подавлен (рН < 7).
Для решения поставленной задачи нами был рассмотрен вариант такого метода с добавкой 5 мМ в-ЦД в раствор образца, содержащий 25 мМ фосфорной кислоты. В отличие от раствора пробы, рабочий буфер содержал ДДСН (рис. 4А). В зоне образца образовывались комплексы определяемых веществ с макроциклической добавкой (рис. 4В). При электрофоретическом разделении компонентов мицеллы проникают в зону пробы, и определяемые вещества распределяются между раствором буферного электролита, раствором, содержащим в-ЦД, и мицеллами (рис. 4 С, 4Б).
Показано, что введен
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.