w
БИООРГЛИИ ЧЕС КАЯ ХИМИЯ, 1995, том 21, M 8, с. 632 - 635
УДК 615.214:57.083.3
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФЕНОБАРБИТАЛА МЕТОДАМИ ТВЕРДОФАЗНОГО ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА. ВЫБОР ОПТИМАЛЬНОЙ СТРАТЕГИИ
© 1995 г. Н. П. Данилова*, Н. И. Бекман, Н. Г. Подымова, А. Л. Максутова*,
Е. В. Железнова*, Р. Г. Василов
Институт биотехнологии, ¡17246, Москва, Научный пр., 8;
* Московский НИИ психиатрии, Москва Поступила в редакцию 18.10.94 г.
Сравниваются характеристики двух вариантов твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) фенобарбитала, основанных на принципе прямого и непрямого ИФА. Оба метода разработаны на основе одних и тех же моноклональных антител, в качестве метки в обоих случаях применялась пе-роксидаза хрена. При использовании в качестве твердой фазы планшетов для микротитрования предпочтение следует отдать методу, основанному на принципе непрямого ИФА, в котором происходит конкуренция фенобарбитала из пробы и фенобарбитала, сорбированного на планшетах в виде конъюгата с белком, за связывание с антифенобарбиталовыми антителами, меченными перок-сидазой, В непрямом ИФА объем пробы 5 мкл, длительность анализа 40 мин, коэффициент вариабельности <8%.
Ключевые слова: иммуноанализ, фенобарбитал
Фенобарбитал - одно из основных средств для лечения эпилепсии. Эффективность его применения значительно возрастает при индивидуальном подборе дозы на основе контроля за концентрацией препарата в крови. Для измерения концентрации фенобарбитала чаще всего используют им-муноаналитические методы [1,2].
В настоящее время в иммуноанализе наметилась тенденция замены поликлональных антител моноклональными. Это объясняется очевидными преимуществами моноклональных антител (высокая специфичность, аффинность и гомогенность), за счет чего достигается улучшение характеристик анализа. Мы получили мышиную гибри-домную линию 1А9, продуцирующую высокоаффинные и специфичные антифенобарбитальные антитела [3]. На основе этих антител был разработан метод иммуноанализа фенобарбитала, базирующийся на принципе поляризации флуоресценции [4], и твердофазный иммунофермент-ный метод, основанный на принципе прямого ИФА [5], в котором на твердой фазе сорбировали антитела, а фенобарбитал метили пероксидазой.
Иммунометрические методы анализа, использующие меченые антитела, меньше разработаны для гаптенов. Это объясняется тем, что с поликло-
Сокращения: BSA - бычий сывороточный альбумин, PB-BSA- конъюгат фенобарбитала с BSA, ИФА - иммуно-ферментный анализ, ЗФР - забуференный физиологический раствор (0,15 M NaCl, 0.01 M фосфат натрия, рН 7.4). # Автор для переписки.
нальными антителами из-за их гетерогенности непрямой ИФА дает менее стабильные результаты, чем прямой ИФА. При переходе на моноклональ-ные гомогенные антитела появляется возможность более широкого использования принципа непрямого ИФА для анализа гаптенов, так как он имеет ряд потенциальных преимуществ: возможность широкого варьирования формы калибровочной кривой путем изменения строения конъюгата гаптена с белком, достижение более высокой чувствительности. Последнее объясняется тем, что если при сорбции антитела теряют до 90% активности [6], то при мечении пероксидазой их активность падает незначительно, к тому же они лучше сохраняются в растворе, чем сорбированными на пластик.
Поэтому целью данной работы было изучение возможности использования полученных нами моноклональных антител для разработки твердофазного иммунометрического метода анализа фенобарбитала и сравнение его параметров с характеристиками метода, основанного на прямом ИФА.
Разработан твердофазный иммунофермент-ный метод для анализа фенобарбитала, основанный на конкуренции между фенобарбиталом из пробы и фенобарбиталом, сорбированным на 96-луночные полистироловые планшеты в виде конъюгата BSA, за связывание с антителами, меченными пероксидазой.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФЕНОБАРБИТАЛА
633
_I_I_I_I_I_
10 20 30 40 50 [Фенобарбитал], мкг/мл
Рис. 3. Калибровочные кривые для определения фенобарбитала методами прямого (1) и непрямого (2) твердофазного ИФА.
750 500 333 222 148 99 [Антитела], нг/мл
Рис. 2. Зависимость связывания антител, меченных пероксидазой, с сорбированным антигеном от концентрации антител.
10 30
ВЭЖХ, мкг/мл
Рис. 4. Сравнение результатов определения фенобарбитала методом ИФА (ось ординат) и методом ВЭЖХ (ось абсцисс).
Рис. 1. Зависимость связывания антител с антигеном PB-BSA от концентрации антигена, используемой при сорбции на планшеты.
1
[Антиген], мкг/мл
Для получения конъюгата фенобарбитала с BSА использовали л<-аминофенобарбитал и глута-ровый альдегид в качестве сшивающего агента. Конъюгат сорбировали на полистироловые 96-луночные планшеты в концентрации 0.5 мкг/мл, минимально необходимой для насыщения твердой фазы (рис. 1).
Антитела из асцитов выделяли ионообменной хроматографией и метили пероксидазой хрена по модифицированному методу Nakane [7]. В качестве рабочего разведения конъюгата применяли разведение, соответствующее 50% связыванию антител с антигеном, сорбированным на твердой фазе (рис. 2).
Иммуноанализ проводили в одну стадию (см. "Экспер. часть"). Концентрацию фенобарбитала в пробе определяли из калибровочной кривой, которая построена на основании значений поглощения, полученных для стандартных растворов фенобарбитала (рис. 3).
Коэффициент вариабельности, результатов анализа, определенный из анализа 30 проб в четырех повторах 10 раз, составлял <8% для всего диапазона измеряемых концентраций.
Результаты анализа хорошо коррелируют с данными, полученными ВЭЖХ (г 0.96) (рис. 4).
Было проведено сравнение параметров этого метода с твердофазным методом определения фенобарбитала, основанным на прямом ИФА, который был разработан и описан нами ранее [5]. В методе использовались полистироловые планшеты, сенсибилизированные моноклональными антителами, и фенобарбитал, меченный пероксидазой хрена.
Оба метода позволяют получить калибровочные кривые, линейные во всем диапазоне терапевтических концентраций фенобарбитала (10-40 мкг/мл) и с углом наклона, близким к 45° (рис. 3).
634
ДАНИЛОВА и др.
Непрямой ИФА
г° *
Прямой ИФА * ПО- *
щгг ЛИ
77777777777777777777 7777777777777777777,
77777777777777777777777 иммобилизован фенобарбитал
* - фенобарбитал, антитела
77777777777777777777777 иммобилизованы антитела
JIO - пероксидаза, Y.
Схема.
Минимально определяемая концентрация в обоих методах одинакова и составляет 2 мкг/мл, но чувствительность в непрямом твердофазном ИФА выше, так как размер пробы в этом методе меньше в 4 раза по сравнению с прямым вариантом (соответственно 5 и 20 мкл).
Очевидно, что на характеристики анализа влияют его кинетические параметры. Мы сравнили кинетику связывания меченых антител с иммобилизованным фенобарбиталом в непрямом ИФА с кинетикой связывания конъюгата фенобарби-тал-пероксидаза с иммобилизованными антителами "в прямом" варианте анализа. В случае непрямого ИФА состояние равновесия достигается за 50 - 60 мин, в то время как в "прямом" варианте этот процесс занимает более 24 ч (рис. 5).
При проведении анализа важно учитывать ошибку, которая может возникать из-за разной скорости внесения проб или прибавления реагентов. В связи с этим при сравнении двух методов бросается в глаза специфика использования полистироловых планшетов в качестве твердой фазы. Как ясно из схемы, в случае прямого ИФА проба, содержащая свободный препарат, должна вноситься в лунку, где уже сорбированы антитела. При этом препарат сразу начинает взаимодействовать с антителами, а поскольку время между внесением пробы и последующим добавлением
Рис. 5. Кинетика иммунохимической реакции в прямом (/) и непрямом (2) твердофазном ИФА.
фенобарбитала, меченного ферментом, будет разным для разных лунок, это приведет к возникновению ошибки. Для ее уменьшения необходимо очень быстрое внесение проб или проведение реакции не на всем планшете, а только на его участке - например, на одном стрипе. Этот недостаток присущ только планшетам; если же в методе в качестве твердой фазы используются, например, полистироловые шарики с антителами, то ошибка не возникает, так как пробу вносят в пустую пробирку, смешивают с меченым лигандом и только затем добавляют твердую фазу с антителами.
В случае непрямого ИФА на планшете иммобилизован конъюгат фенобарбитала с белком, при добавлении пробы никакой реакции не происходит, и, следовательно, скорость внесения проб не влияет на результаты анализа, что обеспечивает преимущество этому варианту анализа.
Таким образом, сравнение двух вариантов твердофазного ИФА на полистироловых планшетах с использованием одних и тех же монокло-нальных антител и одной и той же ферментной метки позволяет сделать вывод о предпочтительности варианта непрямого ИФА.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В работе использовали BSA, пероксидазу из хрена, фенобарбитал, твин-20, глутаровый альдегид, боргидрид натрия (Sigma, США); тетраме-тилбензидин (H-Roche, Швейцария); 96-луночные полистироловые планшеты (Nunc, Дания); DEAE-Toyopearl 650М (Toyo Soda MFG, Япония).
Сыворотки предоставлены клиникой экзоген-но-органических психических нарушений и эпилепсии Московского НИИ психиатрии (руководитель- проф. Э.Л. Максутова).
Конъюгат фенобарбитала с BSA (12 моль PB/моль BSA) синтезировали по описанному методу [3].
Для сорбции на полистироловые планшеты готовили двойные разведения конъюгата PB-BSA в 0.05 M карбонат-бикарбонатном буфере (рН 9.6) в концентрации 8 - 0.0625 мкг/мл и инкубировали с твердой фазой в течение 2 ч при 20°С и 18 ч при 4°С, планшеты отмывали водой и инкубировали 30 мин с 0.1% раствором BSA, промывали и высушивали.
Гибридомную линию 1А9, продуцирующую моноклональные антитела к фенобарбиталу, культивировали в виде асцитных опухолей в мышах, асцитную жидкость отбирали и отделяли от клеток. К 1 мл асцита добавляли 1 мл насыщенного раствора сульфата аммония и после 30 мин инкубации при 4°С осадок отделяли центрифугированием. Осадок растворяли в 0.5 мл воды и диализовали против 1 мМ фосфатного
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФЕНОБАРБИТАЛА
635
буфера, рН 8.0. Затем раствор антител наносили на колонку с DEAE-целлюлозой, уравновешенной
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.