ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2015, том 460, № 1, с. 102-106
БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 57.088,578.832.1,578.52
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ДЕТЕРМИНАНТ УСТОЙЧИВОСТИ ВИРУСА ГРИППА А К АДАМАНТАНАМ И ИНГИБИТОРАМ НЕЙРАМИНИДАЗЫ НА БИОЛОГИЧЕСКОМ МИКРОЧИПЕ
© 2015 г. Р. Н. Гейдаров, Е. Е. Фесенко, Б. Л. Шаскольский, С. А. Клотченко, А. В. Васин, С. В. Титов, E. И. Дементьева, А. С. Заседателев, В. М. Михайлович, академик РАН О. И. Киселев
Поступило 25.08.2014 г.
Б01: 10.7868/80869565215010260
Вирус гриппа А (ВГА) является наиболее частой причиной острых респираторных вирусных инфекций человека. По оценкам Всемирной организации здравоохранения тяжелые осложненные случаи заболевания ежегодно регистрируются у 3—5 млн человек, а количество летальных исходов может достигать 500 тысяч [1].
При терапии гриппа в настоящее время наибольшим лечебным эффектом обладают две группы лекарственных препаратов. Первая группа включает озельтамивир и занамивир — ингибиторы вирусного белка нейраминидазы (НА), играющего важную роль в высвобождении вновь образованных вирусных частиц с поверхности зараженных клеток. Ко второй группе относятся блокаторы вирусного ионного канала (белка М2) — производные адамантана — амантадин и ремантадин, нарушающие способность вируса проникать в клетки и высвобождать рибонуклеопротеид.
В последние несколько лет устойчивость к производным адамантана распространилась повсеместно и она в основном обусловлена наличием мутаций 83Ш и У27А в вирусном гене белка М2, реже встречаются мутации Ь26Б и А30Т [2]. Подавляющее большинство штаммов, устойчивых к ингибиторам нейраминидазы, имеют мутацию И274У в гене белка НА и относятся к подтипу ИШ1 [3].
Способы определения устойчивости вирусов гриппа к противовирусным препаратам можно
Институт молекулярной биологии
им. В.А. Энгельгардта
Российской Академии наук, Москва
Научно-исследовательский институт гриппа,
Санкт-Петербург
Институт биофизики клетки
Российской Академии наук,
Пущино Московской обл.
разделить на две группы. Первая включает методы, основанные на культивировании вируса и изучении влияния различных препаратов на репликацию вируса и активность его белков. К ним относятся метод подавления бляшкообразования [4], иммуноферментный анализ инфицированных клеток [5] и хемилюминесцентный анализ активности нейраминидазы [6].
Во вторую группу входят молекулярно-генети-ческие методы, направленные на идентификацию известных, ассоциированных с лекарственной устойчивостью мутаций в нуклеотидной последовательности вирусного генома. К таким методам относят секвенирование генов белков М2 и НА [7, 8], полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с последующим анализом полиморфизма длин ре-стрикционных фрагментов [9], ПЦР в режиме реального времени [10].
Проведение анализа перечисленными выше методами часто ассоциировано или с повышенными требованиями к оснащению лаборатории и квалификации персонала, либо с продолжительным временем таких анализов, что препятствует широкому использованию данных подходов для рутинного изучения потоков клинических образцов в условиях стандартной клинической лаборатории.
В настоящей работе предлагается метод, основанный на технологии биологических микрочипов и позволяющий одновременно выявлять наличие мутаций в генах белков М2 (83Ш, У27А, Ь26Б и А30Т) и НА (И274У), приводящих к возникновению устойчивости вируса к производным адамантана и ингибиторам нейраминидазы. Анализ выполняется менее чем за сутки, не требует культивирования инфекционного агента и, что представляется крайне важным, может быть использован как метод лабораторного подтверждения клинического диагноза у конкретного пациента.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ДЕТЕРМИНАНТ
103
Определение устойчивости к озельтамивиру и занамивиру
Определение устойчивости к амантадину и ремантадину
Блок анализа мутаций ffi74Y гена NA
I© | © ® © © 01 1
!© © © 1 © @ ©■
© © (N3) © ©II © г J 1 © © ©| г J
!© © (S3) ©
Блок анализа мутаций Блок анализа мутаций Б3Ш и А30Т гена М2 V27A и Ь26Б гена М2
Рис. 1. Схема расположения олигонуклеотидных зондов на биочипе. Незакрашенные ячейки содержат зонды, специфичные последовательностям дикого типа; серым цветом выделены ячейки, содержащие зонды, комплементарные последовательностям, несущим мутации; заштрихованные ячейки не содержат зондов и служат для расчета неспецифического фонового сигнала. Рамками выделены три блока ячеек, отвечающих за определение мутаций, обозначенных в подписи к блоку. Последовательности зондов приведены в табл. 1.
Для разработки метода были использованы охарактеризованные штаммы вируса гриппа A (с титром 1/32 и выше, определенным на основе реакции гемагглютинации), любезно предоставленные НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского. Вирусную РНК выделяли с помощью коммерческого набора ("НАРВАК", Россия) либо TRI Reagent ("Sigma", США), согласно инструкциям производителей. Обратную транскрипцию (ОТ) образцов РНК проводили с использованием набора REVERTA-L (ЦНИИ эпидемиологии, Россия) согласно протоколу изготовителя. Подготовка проб для гибридизации включала двухэтапную мультиплексную ПЦР, проводимую, как описано ранее [11]. Реакционная смесь второго раунда ПЦР включала флуоресцентно меченный три-фосфат IMD-dU49 ("БИОЧИП-ИМБ", Россия).
Продуктом двухэтапной амплификации являлись одноцепочные флуоресцентно меченные целевые фрагменты генов белков M2 (позиции 725— 838, Ac.No. GU211220) и NA (позиции 712-887, Ac .No. GQ476140), которые в последующем ги-бридизовали с олигонуклеотидными зондами, иммобилизованными на биочипе, как описано ранее [11]. Регистрацию результатов и обработку изображений выполняли на "Универсальном аппаратно-программном комплексе для анализа биологических микрочипов" ("БИОЧИП-ИМБ").
В результате работы был создан биологический микрочип, позволяющий детектировать наличие мутации H274Y в гене белка NA первого подтипа (N1) и мутаций S31N, V27A, L26F и A30T в гене белка M2 вируса гриппа А.
Мутация H274Y в гене белка NA первого подтипа (N1) возникает вследствие однонуклеотид-
ной замены цитозина (С) на урацил (и) в позиции 823 (Ac.No. GQ476140). В связи с высоким уровнем изменчивости генов ВГА соседствующие с позицией 823 нуклеотиды могут отличаться у разных штаммов. Для детекции замены С823и в геномах максимального числа штаммов, характеризующихся различными вариантами нуклеотидной последовательности в исследуемом участке, были подобраны 6 пар вырожденных зондов, соответствующих участку 814-836 (Ac.No. GQ476140). Внутри каждой пары зонды отличались только по нуклеотидной позиции 823. При этом один из зондов был комплементарен последовательности, несущей мутацию, а второй — последовательности дикого типа.
Аналогичным образом были подобраны 4 пары зондов для определения мутации Б3Ш (замена G793А) и 3 пары зондов — для определения мутации У27А (замена и781С) в гене белка М2 (Ac.No. GU211220). Помимо зондов к основным мутациям для анализа гена белка М2 были подобраны два зонда к минорным мутациям Ь26Б и А30Т (табл. 1).
Схема разработанного микрочипа представлена на рис. 1. Микрочипы были изготовлены по разработанной ранее технологии [12] и содержат 30 гелевых элементов (ячеек). В 28 ячейках иммобилизованы специфические олигонуклеотидные зонды. Оставшиеся две ячейки используются в качестве контрольных элементов для вычисления фоновых сигналов. Гелевые ячейки с зондами сгруппированы в 3 блока. Каждый из блоков 83Ш/А30Т и У27А/Ь26Б отвечает за определение двух мутаций в гене белка М2, блок И274У — за идентификацию мутации в гене белка NA. Блоки
104 ГЕЙДАРОВ и др.
Таблица 1. Нуклеотидные последовательности зондов
Белковые продукты генов ВГА Мутация Обозначение зонда на рис. 1 Нуклеотидная последовательность зонда Позиция Ac.No.
М2 S31N 81 TTGCHGCRAGTATCATTGG 771- 789 CY083482
М2 S31N Н1 ATTGCHGCRAATATCATTGG 783- 802 GU211220
М2 S31N 82 TTGCCGCAAGTRTARTTGG 795- 814 GQ476141
М2 S31N Н2 GTTGCCGCAAATRTARTTGG 771- 789 EU100612
М2 S31N 83 GTTGCMGCAAGTATMATTGG 770- 778 GQ476141
М2 S31N Н3 GTTGCMGCAAATATMATTGGG 795- 815 EU100612
М2 S31N 84/А1 TTGCCGCRAGTATMATTGG 771- 789 GQ476141
М2 S31N Н4 GTTGCCGCRAATATMATTGG 795- 814 EU100612
М2 A30T Т1 GTTGCCACRAGTATMATTGG 777- 796 CY039977
М2 V27A У1 GTRATCCTCTCGTYATTGC 769- 787 GU211220
М2 V27A А1 TRATCCTCTCGCYATTGC 762- 779 CY054996
М2 V27A У2 TGATCCKCTYGTTGTTGC 757- 774 GQ476141
М2 V27A А2 GATCCKCTYGCTGTTGC 765- 781 CY125665
М2 V27A У3/Ь1 TGACCCKCTTGTTRTTGC 764- 781 CY039977
М2 V27A А3 ACCCKCTTGCTRTTGC 769- 784 CY091526
М2 L26F TGACCCKTTTGTTRTTGC 782- 799 EU273778
НА H274Y И1 CCHAAT TACCACTAYGAGGART 814- 835 JQ348834
НА H274Y У1 CCHAAT TACTACTAYGAGGARTG 814- 836 KC882409
НА H274Y И2 CCCAATTHTCATTAYGAGGART 822- 843 CY125134
НА H274Y У2 CCCAATTHTTATTAYGAGGARTG 814- 836 GQ476140
НА H274Y И3 CCTAATTMT CACTAYGAGGART 823- 844 CY129912
НА H274Y У3 CCTAATTMT TACTAYGAGGARTG 814- 836 GU571155
НА H274Y И4 CCCAATTTYCAYTATGAGGART 814- 835 EU516135
НА H274Y У4 CCCAATTTYTAYTAT GAGGARTG 814- 836 GQ476140
НА H274Y И5 CCYAAYTACCATTAYGAGGART 814- 835 KC488881
НА H274Y У5 CCYAAYTA CTATTAYGAGGARTG 814- 836 GQ476140
НА H274Y И6 CCYAAYTATCACTAYGAGGART 823- 844 CY129912
НА H274Y У6 CCYAAYTATTACTAYGAGGARTG 814- 836 GU571155
Примечание. Обозначения вырожденных оснований (Я, У, М и т. д.) приводятся в соответствии с рекомендациями Комитета по номенклатуре международного союза по биохимии и молекулярной биологии: Я = А, G; У = С, Т; М = А, С; К = G, Т; И = А, С, Т [14]. Вырожденные основания выделены серым цветом. Позиции мутаций выделены полужирным шрифтом и серым цветом.
содержат два горизонтальных ряда ячеек: в нижнем ряду иммобилизованы зонды, комплементарные последовательности дикого типа (незакрашенные ячейки); в верхнем ряду расположены зонды, комплементарные последовательностям с мутациями (ячейки серого цвета).
При гибридизации одноцепочных флуоресцентно меченных продуктов амплификации фрагментов генов белков М2 и НА накопление доминирующих флуоресцентных сигналов происходит в ячейках, содержа
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.