ГЕНОМИКА. ТРАНСКРИПТОМИКА
УДК 577.2
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТЕРМИНАЛЬНЫХ МУТАЦИЙ В ГЕНАХ BRCA1, BRCA2 И CHEK2 С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БИОЧИПОВ У БОЛЬНЫХ РАКОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
© 2014 г. Т. В. Наседкина1*, О. Е. Громыко1, М. А. Емельянова1, Е. О. Игнатова2, Т. П. Казубская2, С. М. Портной2, А. С. Заседателев1, Л. Н. Любченко2
Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук, Москва, 119991 2Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина Российской академии медицинских наук, Москва,115478 Поступила в редакцию 16.11.2012 г. После последней доработки 27.08.2013 г. Принята к печати 28.08.2013 г.
Выявление герминальных мутаций в генах BRCA1/2 и CHEK2 составляет основу молекулярной диагностики предрасположенности женщин к раку молочной железы и яичников. Нами разработана методика быстрого генотипирования мутаций в гене BRCA1 (185delAG, 300Т>С, 4153delA, 4158 Л>С, 5382^С), гене BRCA2 (695 Ш8С, 6174delT) и гене CHEK2 (1l00delC) с использованием биочипов. Протестировано 412 больных РМЖ, из случайной выборки (без учета семейной истории) по Центральной России. У 25 (6.0%) из них рак молочной железы диагностирован в составе первично-множественных злокачественных новообразований (рак яичников, колоректальный рак, рак шейки матки и т.д.). Мутации BRCA1/2 и CHEK2 определены у 33 (8.0%) больных РМЖ. Наиболее часто встречаются мутации 5382т8С в гене BRCA1 (3.9% от общего числа пациенток) и 1100delC в гене CHEK2 (1.7% соответственно). Предлагаемый метод эффективен при обнаружении наиболее распространенных в Центральной России герминальных мутаций в генах BRCA1/2 и CHEK2 , что позволяет использовать его в качестве высокопроизводительного диагностического инструмента в клинической онкологической практике.
Ключевые слова: рак молочной железы, терминальные мутации, BRCA1/2, CHEK2, диагностика, биочипы.
GENOTYPING OF BRCA1, BRCA2 AND CHEK2 GERMLINE MUTATIONS IN RUSSIAN BREAST CANCER PATIENTS USING DIAGNOSTIC BIOCHIPS, T. V. Nasedkina1*, O. E. Gromyko1, M. A. Emelyanova1, E. O. Ignatova2, T. P. Kazubskaya2, S. M. Portnoi2, A. S. Zasedatelev1, L. N. Lyubchenko2 (1Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences , Moscow, 119991 Russia, *e-mail: nased@eimb.ru; 2Blochin Russian Cancer Research Center, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow, 115478 Russia). Germline mutations of BRCA1/2 genes cause the predisposition of their carriers to breast or/and ovary cancers (BC or/and OC) during the lifetime. Identification of these mutations is a basis of molecular diagnosis for BC susceptibility. Rapid genotyping technique using microarrays for identification of BRCA1 185delAG, 300T>G, 4153delA, 5382insC mutations and 4158 A>G sequence variant; BRCA2 695insT and 6174delT mutations; 1100delC mutation in CHEK2 gene was applied for 412 randomly collected breast cancer samples from the central region of European area of Russia. In 25 (6.0%) patients (6.0%) BC was associated with other tumours: OC, cervical cancer, colorectal cancer etc. BRCA1/2 and CHEK2 mutations were found in 33 (8.0%) BC patients. The most frequent mutation was BRCA1 5382insC, occurred in 16 (3.9%) BC patients, and CHEK2 1100delC, revealed in 7 (1.7%) BC patients. An application of diagnostic BC-microarray for genetic testing of BRCA1/2 and CHEK2 founder mutations has been discussed.
Keywords: breast cancer, germline mutations, BRCA1/2, CHEK2, diagnostics, biochips. DOI: 10.7868/S0026898414020141
Принятые сокращения: BRCA1 (breast cancer 1) — ген рака молочной железы 1; BRCA2 (breast cancer 2) — ген рака молочной железы 2; CHEK2 (checkpoint kinase 2) — ген киназы контрольной точки клеточного цикла (чекпойнт-киназы); ТР53 (tumor protein p53) — ген опухолевого белка p53; PTEN (phosphatase and tensin homolog) — ген фосфатазы и гомолога тензина; PALB2 (partner and localizer of BRCA2) — ген партнера и локализатора BRCA2; BRlPl (BRCA1 interacting protein C-terminal helicase 1) — ген взаимодействующего с BRCA1 белка 1, обладающего С-концевой хеликазной активностью; ПМЗН — первично-множественные злокачественные новообразования.
* Эл. почта: nased@eimb.ru
243
4*
В структуре онкологических заболеваний у женщин рак молочной железы занимает лидирующие позиции, в развитых странах он возникает примерно у каждой десятой женщины [1]. От 5 до 15% всех случаев рака молочной железы представлены наследственными формами, ассоциированными с терминальными мутациями (germline mutations, мутации в клетках зародышевой линии) в генах BRCA1 (breast cancer 1), BRCA2 (breast cancer 2), CHEK2 (checkpoint kinase 2), TP53 (tumor protein p53), PTEN (phosphatase and tensin homolog), PALB2 (partner and localizer of BRCA2), BRIP1 (BRCA1 interacting protein C-terminal heli-case 1) [2-4].
Около 80% всех случаев наследственного рака молочной железы обусловлены мутациями в генах BRCA1 [MIN 113705] и BRCA2 [MIN 600185] [5]. Мутации в гене CHEK2 встречаются в 5% случаев [6]. Риск возникновения рака молочной железы у женщин, носителей мутаций в генах BRCA1/2, может достигать 80-90%, в то время, как риск развития рака яичников (РЯ) составляет 50-60% и 20-30% у носителей мутаций BRCA1 и BRCA2 соответственно [5, 7]. Важно отметить, что относительный риск развития опухоли у носителей мутаций после 42 лет возрастает на порядок - по сравнению со среднепопуляционным риском, тогда как мутации в гене CHEK2 повышают риск не более чем в 2-3 раза [8].
В настоящее время известно более 1500 мутаций в гене BRCA1 и более 1800 - в гене BRCA2 (Breast Cancer Information Core (BIC) Data Base, http://research.nhgri.nih.gov/projects/bic/), спектр и частота которых различаются в разных странах и этнических группах. Например, из трех мутаций-основателей (founder mutations) у евреев-аш-кенази (BRCA1 185delAG and 5382insC; BRCA2 6174 delT [9, 10]), мутация 5382insC наиболее распространена во всех европейских популяциях [11-14], а другие мутации, например, 4153delA, чаще встречаются в Восточной Европе [11, 1517]. Во многих странах спектр мутаций настолько широк, что в процессе медико-генетического консультирования необходимо полностью секве-нировать гены BRCA1 и BRCA2. На территории России у больных раком молочной железы и раком яичников чаще выявляется определенная группа неблагоприятных мутаций BRCA1/BRCA2 [18-23]. Эти данные позволяют разрабатывать различные методы генетического тестирования пациентов, например на основе аллель-специфичной ПЦР в реальном времени [22]. Нами разработан быстрый и высокопроизводительный метод генотипирования мутаций BRCA1, BRCA2 и CHEK2 в российской популяции на основе технологии биочипов. Ранее этот подход был применен для скрининга пациенток, больных раком яичника [23].
В предыдущих исследованиях больных раком молочной железы использовали, в основном, выборки больных с учетом семейной истории и/или клинических характеристик. Кроме того, определяли носительство отдельных мутаций — ВЯСА1 5183тзС и 1000ёе1С СНЕК2 [19, 20, 24]. В настоящей работе нами исследован спектр и частота некоторых мутаций в генах ВЯСА1, ВЯСА2 и СНЕК2 на большой случайной выборке больных раком молочной железы, жителей Центральной России, без учета семейной истории в анамнезе, с использованием методики генотипирования на основе технологии биочипов.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Материалы и методы. В работе использовали образцы периферической венозной крови 412 женщин с диагнозом "рак молочной железы" или диагнозом "первично-множественные злокачественные новообразования (ПМЗН) с поражением молочной железы". Все пациентки — жительницы Центрального региона РФ, проходившие лечение в Российском онкологическом научном центре им. Н.Н. Блохина РАМН. Диагноз устанавливали на основании клинического обследования, а также данных лабораторных и инструментальных методов. У 25 пациенток рак молочной железы был диагностирован в составе ПМЗН наряду с раком яичников (13 пациенток), раком тела матки (7), коло-ректальным раком (2), раком желудка, шейки матки и меланомы кожи (по одному случаю). Возраст пациенток — от 24 до 79 лет, средний возраст — 53.0 ± 9.6 года. В выборку вошли неродственные индивиды, без предварительного рассмотрения их семейной истории. После молекулярно-генети-ческого анализа на наличие мутаций в генах BRCA1, BRCA2 и CHEK2 у носителей мутаций ретроспективно прослеживали семейную историю.
Геномную ДНК выделяли из лейкоцитов периферической крови с использованием стандартного метода депротеинизации смесью фенола и хлороформа [25].
Полимеразная цепная реакция. Фрагменты генов BRCA1/2 и CHEK2 амплифицировали с помощью гнездовой мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в два этапа. В этом случае одновременно амплифицировали четыре участка гена BRCA1, два участка гена BRCA2 и один участок гена CHEK2. Последовательности используемых праймеров могут быть предоставлены по запросу. Условия проведения ПЦР описаны ранее [26].
Изготовление биочипов. Олигонуклеотиды, предназначенные для иммобилизации на биочипе, синтезировали на автоматическом синтезаторе 394 DNA/RNA Synthesizer ("Applied Biosystems", США) с использованием стандартного
фосфорамидитного метода. 3'-конец олигонук-леотидов содержит спейсер со свободной аминогруппой, который вводили в состав олигонуклео-тида при его синтезе с использованием реактива 3'-Amino-Modifier C7 CPG 500 ("Glen Research", США). Пример последовательности иммобилизованных олигонуклеотидов приведен ранее [26]. Биочипы изготовливали методом фотоиндуциру-емой совместной полимеризации олигонуклео-тидов и компонентов акриламидного геля, как описано ранее [27].
Гибридизация и анализ флуоресцентного сигнала. Для гибридизации, регистрации и обработки флуоресцентного изображения биочипа использовали портативный анализатор биочипов ("Био-чип-ИМБ", Россия) [26]. Для анализа применяли программу "ImageWare", разработанную в Лаборатории биологических микрочипов ИМБ им. В.А. Энгельгардта РАН.
РМЖ-биочип содержит набор из 16 олигонук-леотидных зондов, расположенных в восьми рядах, каждый из которых соответствует одной анализируемой нуклеотидной позиции. Ячейки с зонда
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.