ЖУРНАЛ АНАЛИТИЧЕСКОЙ ХИМИИ, 2007, том 62, № 1, с. 59-65
^=ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ =
УДК 591.83+547.962.9
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГИДРОКСИПРОЛИНА В ТКАНЯХ И ОЦЕНКА СОДЕРЖАНИЯ В НИХ КОЛЛАГЕНА
© 2007 г. Н. Ю. Игнатьева***, Н. А. Данилов*, С. В. Аверкиев***, М. В. Обрезкова*,
В. В. Лунин*, Э. Н. Соболь**
*Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, химический факультет
119899 Москва, Ленинские горы **Институт проблем лазеров и информационных технологий Российской академии наук
Московская область, Троицк Поступила в редакцию 05.09.2005 г.
Определено содержание гидроксипролина - аминокислоты, специфичной для коллагена, в ряде соединительных тканей. Сравнивали две методики. По первой - аминокислоты предварительно разделяли хроматографически, а затем определяли на стандартном аминокислотном анализаторе, по второй - без разделения аминокислот селективно окисляли гидроксипролин и определяли его по спектрофотометрической реакции с реактивом Эрлиха. Для препаратов очищенного коллагена данные, полученные по двум методикам, находятся в хорошем согласии. В неочищенных препаратах и тканях результаты могут несколько различаться из-за наличия в тканях полисахаридных компонентов.
Одной из важных задач молекулярной биологии является установление связи физических и физико-химических свойств ткани с ее биохимическим составом и надмолекулярной структурой. Коллаген является основным белком соединительных тканей, которые выполняют важнейшие опорные, защитные и другие функции в организме. Он определяет их механические свойства. В связи с этим очень важно проследить изменение содержание коллагена в тканях с возрастом, а также в связи с некоторыми заболеваниями. Для этого нужны надежные и недорогие методы его определения. Целью данной работы является сравнение двух методик определения количества коллагена в образцах чистого коллагена, хряща и межпозвоночного диска.
Существует не менее 18 различных молекулярных форм коллагена, отличающихся структурой, а в некоторых случаях и пространственным строением. При этом разные виды коллагена по-разному распределены в органах и тканях [1]. Коллаген типа I, наиболее распространенный в организме и содержащийся в коже, сухожилиях, костях, роговице глаза, построен из двух полипептидных цепей: а1(1) и отличающейся от нее своей первичной структурой цепи а2(1); коллаген II типа образован тремя одинаковыми полипептидными цепями а(Й). Каждая из полипептидных цепей коллагена состоит примерно из 1000 аминокислотных остатков.
В первичной структуре полипептидных цепей коллагенов ^ГУ четко выражен повторяющийся на протяжении всей цепи структурный мотив:
Gly-Xaa-Yaa (где Xaa и Yaa - различные аминокислоты); весьма часто встречается структура Gly-Pro-Hyp. Этому соответствует высокое содержание глицина (>30%) и пролина, а также гидроксипролина (далее Hyp). Различные типы коллагена весьма значительно отличаются молярным отношением Hyp/Hyl (см. табл. 1), что может быть использовано для их идентификации [2].
Гидроксипролин, встречающийся только в коллагене и эластине, образуется как результат ко-трансляционного гидроксилирования пролина ферментом пролингидроксилазой, которое происходит еще до завершения синтеза полипептидной цепи. Ему подвергается 4-й углеродный атом остатков пролина, которые предшествуют остаткам глицина в последовательности Pro-Gly-Xaa-Yaa. Аналогичным образом (котрансляционно), лизингидрок-
Таблица 1. Молярное отношение Hyp/Hyl
Тип коллагена/источник Молярное отношение Hyp/Hyl
Коллаген I (кожа теплокровных) 11-18
Коллаген II (хрящ гортани свиньи) 4.30
Коллаген II (хрящ цыпленка) 4.50
Коллаген III (кожа теленка) 17.0
Коллаген III (печень человека) 22.6
Коллаген IV (хрусталик человека) 3.00
Коллаген IV (хрусталик овцы) 2.60
силаза гидроксилирует по 5-углеродным атомам остатки лизина, предшествующие глицину.
Методы определения коллагена в образцах ткани подразделяются на две большие группы. Первая из них использует иммунохимические подходы, а другая - все остальные.
Иммунохимический анализ позволяет определять непосредственно конкретные типы коллагена как определенные белковые структуры, детектируемые им как единое целое [3, 4]. К недостаткам этого метода следует отнести необходимость получения антитела к данному коллагену и применение специальных препаратов.
Другой подход состоит в полном гидролизе образца до аминокислот и дальнейшем определении отдельных аминокислот. При этом основное внимание уделяется определению содержания гид-роксипролина - иминокислоты, специфичной для коллагена [1] (содержание около 13%). Самые точные результаты дает метод с предварительным хроматографическим разделением аминокислот, который позволяет обеспечить возможность последующего спектрофотометрического детектирования гидроксипролина.
Весьма интересной является возможность применения спектрофотометрических методов для определения содержания гидроксипролина в образце без предварительного разделения компонентов ткани, что сильно упрощает анализ и снижает его стоимость. При этом на первое место выходит выбор спектрофотометрической реакции.
Один из подобных способов определения гидроксипролина основан на взаимодействии последнего с нингидрином [5] (гидратом 1,2,3-триоксоин-дана), дающим окрашенные продукты при взаимодействии с веществами, содержащими аминогруппу. Так как с нингидрином способны реагировать все аминокислоты, первоначально проводят обработку анализируемого раствора нитритом натрия, приводящую к окислению всех аминогрупп с образованием спиртов и алкенов. Ключевым недостатком этого метода является определение суммарного содержания Hyp и Pro, которые невозможно определять отдельно при совместном присутствии. Кроме того, весьма спорно предположение об отсутствии каких-либо превращений ими-нокислот на стадии разложения аминокислот, так как вторичные амины взаимодействуют с азотистой кислотой с образованием N-нитрозаминов [6].
Другой метод определения гидроксипролина основан на взаимодействии реактива Эрлиха с продуктами окисления гидроксипролина [7-9]. Химизм процесса можно описать следующим об-
разом. Структура гидроксипролина содержит себе пирролидиновое кольцо,
HO
.OH
NH
O
способное к окислительному дегидрированию в пиррольное, которое впоследствии может быть определено с помощью реакции с реактивом Эрлиха - 4-^^-диметиламино)бензальдегидом [10]. Получающееся соединение хиноидной структуры
/
NH
является интенсивно окрашенным (цвет зависит от заместителей и меняется от оранжевого до сиреневого).
В качестве окислителя используется хлорамин Т (натриевая соль ^хлоро-4-толуолсульфонами-да). К несомненным достоинствам данного окислителя следует отнести дешевизну, легкость разрушения его избытка, отсутствие окрашенных продуктов восстановления.
Реакцию окисления проводят в буферном растворе с pH ~ 6. Так как при данном pH реактив Эрлиха нерастворим в воде, в систему добавляют ме-тилцеллозольв, хорошо смешивающийся с водой. В связи с возможностью окисления диметилами-нобензальдегида хлорамином избыток последнего разрушают добавлением хлорной кислоты. Выделение процесса разрушения избытка окислителя в отдельную стадию процесса перед добавлением реактива Эрлиха, имеет преимущества перед одновременным прибавлением реактива Эрлиха и кислоты, так как в последнем случае остается возможным частичное окисление реактива Эрлиха.
Следует отметить тот факт, что протеоглика-ны, часто сопутствующие коллагену в тканях не должны мешать проведению анализа, ибо в реакцию с реактивом Эрлиха они вступают лишь после предварительной обработки ацетилацетоном [11].
Целью настоящей работы являлось сравнение методик определения гидроксипролина хромато-графическим методом с разделением аминокислот и спектрофотометрическим методом без предварительного разделения аминокислот. В данной работе при проведении спектрофотометрических определений Hyp придерживались методики, упомянутой в [7], однако вместо метилцеллозольва использовали этилцеллозольв, который также хорошо растворяет реактив Эрлиха, а вместо хлора-
мина Т - идентичный по свойствам хлорамин В (натриевая соль ^хлоро-4-бензолсульфонамида).
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Материалы. Использовали следующие материалы и реактивы: коллаген типа I, растворимый в кислотах, из кожи теленка, ("ICN Biomedicals Inc.", США); коллаген типа I, нерастворимый в кислотах, из ахилловых сухожилий быка, ("Sigma", США); хрящ носовой перегородки 12-месячного поросенка; пульпозное ядро межпозвоночного диска 12-месячного теленка; внешняя часть фиброзного кольца межпозвоночного диска 12-месячного теленка. Для анализа брали высушенные на воздухе при комнатной температуре препараты тканей.
Гидроксипролин кристаллический ("Sigma", США).
Хондроитинсулъфат "I", порошок (далее -ХС) ("BIOIBERICA", Испания).
Этилцеллозолъв ("Химмед", Россия) марки х.ч. Реактив высушивали над безводным CaCl2, затем перегоняли, собирая фракцию с температурой кипения 135°С.
Хлорная кислота (HClO4) ("РеаХим", Россия) марки "ос. ч.". 50 мл 3.15М раствора (d = 1.180 г/см3) готовили, добавляя 11 мл 62%-ной кислоты (d = = 1.554 г/см3) к 49 мл дистиллированной воды.
Буферный раствор. 36.18 г ацетата натрия, 25 г лимонной кислоты, 6 мл ледяной уксусной кислоты, 17 г гидроксида натрия доводили до суммарного объема 500 мл дистиллированной водой (все реактивы фирмы "Реахим", Россия; марки х.ч.).
4-(N,N-Диметиламино)бензалъдегид (реактив Эрлиха) ("VE Auben und betrieb", Германия) марки "ч. д. а.". 20%-ный раствор готовили непосредственно перед каждым опытом растворением 3 г кристаллического препарата (п-ДАБ) в 12 г этил-целлозольва при слабом нагревании.
Раствор хлорамина-В: 1.068 г натриевой соли хлорамида бензолсульфоновой кислоты ("УфаХим-Пром", Россия) марки х.ч. растворяли в 20 мл дистиллированной воды, после чего добавляли 30 мл этилцеллозольва и 50 мл буфера. Раствор готовили непосредственно перед каждым опытом.
В работе использовали стеклянные флаконы с завинчивающимися крышками с тефлоновыми прокладками объемом 25 мл.
Для отбора определенных объемов реагентов применяли микродозаторы "Ленпитет" (Рос
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.