ЖУРНАЛ АНАЛИТИЧЕСКОЙ ХИМИИ, 2007, том 62, № 4, с. 429-435
^=ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 543.257.2
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЛЮКОЗЫ И ЛАКТОЗЫ В ПРОДУКТАХ ПИТАНИЯ С ПОМОЩЬЮ БИОСЕНСОРОВ НА ОСНОВЕ БЕРЛИНСКОЙ ЛАЗУРИ
© 2007 г. Л. В. Лукачева, А. А. Закемовская, Е. Е. Карякина, И. Н. Зоров, А. П. Синицын,
М. В. Сухачева, А. И. Нетрусов, А. А. Карякин
Московский государственный университет им. М.ВЛомоносова, химический факультет
119992 Москва, Ленинские горы Поступила в редакцию 17.11.2005 г., после доработки 15.06.2006 г.
Иммобилизация ферментов в мембраны полиэлектролитов с использованием органических растворителей применена для создания биочувствительных элементов биосенсоров. Использовали препараты отечественного производства - ферменты глюкозооксидаза, Р-галактозидаза и перфторсуль-фонированный полимер. Оптимизирован состав моно- и биферментных полиэлектролитных мембран. Глюкозный и лактозный биосенсоры на основе Берлинской лазури (как преобразователя сигнала) и мембран полиэлектролита обладали высокой чувствительностью, малым пределом обнаружения и быстрым откликом. Результаты анализа молочной сыворотки в проточно-инжекцион-ной системе, включающей биосенсоры, полностью коррелировали с данными измерений стандартным хроматографическим методом.
Согласно рекомендациям ИЮПАК, биосенсором можно назвать лишь то устройство, в котором элемент биологического распознавания находится в прямом пространственном контакте с преобразователем сигнала [1]. В случае ферментных электродов это означает, что ферменты должны быть иммобилизованы непосредственно на поверхности модифицированного электрода. Поэтому важными показателями эффективности способа иммобилизации могут служить чувствительность биосенсора, простота и воспроизводимость методики, минимизация расхода реагентов.
Для создания ферментных мембран широко используют ионообменные полиэлектролиты, особенно Нафион® - сополимер на основе тетрафтор-этилена и перфторалкилвинилового эфира производства компании Sigma-Aldrich. Главные преимущества этого полимера - совместимость с биологическими тканями (т.е. возможность использования в имплантируемых сенсорах), низкое удельное электрическое сопротивление, хорошая адгезия к материалам электродов [2, 3].
(СР2-СР2)х(СР-СР2)у
О-(СзРб)-О-80-Н+ Нафион®
Поскольку Нафион® поставляется в виде раствора в смеси спиртов, процедура приготовления мембраны сводится к нанесению капли смеси фермента и полиэлектролита на электрод с последующим высушиванием на воздухе до испарения растворителя. Однако в ранних работах [4] избыточное разбавление препарата Нафиона®
водой или буфером для предотвращения инактивации ферментов под действием органического растворителя приводило к тому, что нанесенные мембраны были неоднородны и, как следствие, нестабильны.
Нами предложен новый подход к созданию мембран на основе полиэлектролитов с использованием водно-органических смесей с высоким содержанием органического растворителя [5]. Показано, что некоторые ферменты, в числе которых глюкозооксидаза (ГОД) из Aspergillus niger, сохраняют активность после инкубирования в 85-95%-ных органических растворителях. Более того, Нафион® способен стабилизировать фермент в таких средах за счет формирования фермент-полиэлектролитных комплексов [6]. Таким образом, были получены высокоактивные и стабильные полиэлектролитные мембраны. Показана высокая стабильность смесей фермента и Нафиона в органической среде при хранении: через 5 дней хранения смеси активность мембраны не отличалась от активности свежеприготовленной мембраны. Это позволяет сократить расход дорогостоящих ферментов и повысить воспроизводимость при серийном изготовлении сенсоров.
Примером использования разработанного способа иммобилизации может служить глюкозный биосенсор на основе Берлинской лазури [6]. Пе-роксид водорода, образующийся в ходе ферментативной реакции (1), восстанавливается на поверхности Берлинской лазури (2):
Глюкоза
год
Глюконолактон + Н20
2^2»
H2O2 + 2e
2OH-
(1) (2)
По чувствительности (0.05 A/M см2), полученный по новой методике сенсор в 20 раз превосходит разработанный ранее аналогичный датчик без стабилизации фермента полиэлектролитом. Предел обнаружения был снижен в 5 раз и достиг 1 х 10-7 M. По сравнению с другими биосенсорами первого поколения на основе гексацианоферра-тов чувствительность определения глюкозы увеличена в 100 раз [6].
Представляет интерес создание мультифер-ментных мембран на основе полиэлектролитов. Многие аналитически важные соединения можно определелять с помощью последовательных ферментативных реакций, например, при разложении лактозы под действием в-галактозидазы (ГЛД):
ГЛД
лактоза —► галактоза + глюкоза (3)
и далее по реакциям (2) и (3) аналогично определению глюкозы.
Лактоза - основной углевод, присутствующий в молоке (4-5%) и молочных продуктах. Ее содержание в пищевых продуктах указывает на количество добавленного в них порошкового молока. Лактозу в молочных продуктах постоянно определяют в молочной промышленности для обеспечения эффективности процесса и контроля качества продуктов. Описан [7] амперометрический биосенсор, основанный на иммобилизации ГОД, ГЛД, мутаротазы и ферроцена в циклодекстрино-вый полимер на поверхности стеклоуглеродного электрода. Ферроцен служил медиатором между ГОД и электродом. Время отклика 40 с. Линейный диапазон определяемых содержаний 5 х 10-51.2 х 10-2 М. Чувствительность 0.003 A/M см2. Предложен [8] амперометрический биосенсор, основанный на включении N-метилфеназина ме-тасульфата (N-МФ) в пленку Нафиона в качестве медиатора между пероксидазой и электродом. С помощью глутарового альдегида произведена иммобилизация пероксидазы, ГОД и ГЛД на поверхности стеклоуглеродного электрода, модифицированного Нафион-N-Mî. Линейный диапазон определяемых содержаний лактозы 5 х 10-6-7 х 10-3 М, чувствительность 0.006 A/M см2. Включение дополнительных ферментов (пероксидазы и мутаротазы) в биосенсоры медиаторного типа требует совместной иммобилизации нескольких ферментов, катализирующих последовательные реакции, а это уменьшает стабильность и воспроизводимость датчиков.
Ранее в наших работах по созданию биосенсоров применялись препараты ферментов и полиэлектролит Нафион производства Sigma-Aldrich. Цель данной работы - применение новых препаратов для создания биочувствительных элементов сенсоров. Для этого использованы ферментные препараты глюкозооксидазы и в-галактозидазы, выделенные в ходе совместных исследований HBîM РАН
(г. Пущино) и кафедры химической энзимологии M^ им. Ломоносова, а также перфторсульфони-рованный полиэлектролит ("Пластполимер", Санкт-Петербург). Использование новых отечественных препаратов позволит, во-первых, изучить возможности и ограничения разработанного ранее метода иммобилизации, во-вторых, существенно снизить затраты при серийном производстве сенсоров.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Материалы. Все эксперименты проводили в дистиллированной воде. Использованные в работе неорганические соли и кислоты (ч.д.а.), органические растворители (х.ч.), лактоза и глюкоза были приобретены в российских и зарубежных фирмах. Для нейтрализации растворов ПФС использовали 25%-ный раствор NH3 аммония (Феррейн, Россия). Для иммобилизации ферментов применяли перфторсульфонированный полимер (ПФС) (M3 1000, 14%-ный раствор в изопропано-ле) производства "Пластполимер" (Россия).
Глюкозооксидаза (ЕС 1.1.3.4) из Pénicillium vitale в виде раствора фермента, очищенного до гомогенного состояния, с концентрацией 15 мг/мл, имела активность 73 ME/мг. Ферментный препарат Pénicillium canescence # 579.1 с мультикопиро-ванным геном в-галактозидазы был получен из HBîM РАН, г. Пущино. Препарат очищали при помощи хроматографической системы умеренного давления FPLC (Pharmacia, Швеция) на колонке Mono Q. После этого концентрация фермента в растворе составила 46.4 мг/мл, активность по лактозе 3510 ME/мл. Mолочная сыворотка получена из молока 1.5% жирности (Россия) путем сбраживания молока при рН 4.
Растворы, используемые в работе: фоновый электролит (0.1 M KCl, 0.1 M HCl); буфер 2 (0.1 M KCl, 0.05 M KH2PO4 pH 6.0); буфер 3 (0.05 M KH2PO4, рН 5.5).
Оборудование. Использовали дисковые стек-лоуглеродные электроды (d = 2 мм) марки 2500 производства НИИ "Графит" (Россия). Предобработку электродов проводили порошками оксида алюминия (Buehler, США) с диаметром зерна 3 и 0.5 мкм. Кислородный электрод Кларка имел рабочие ячейки объемом 1.2-1.5 мл. Электрохимические измерения проводили с помощью потен-циостата модели 1286 (Solartron, Великобритания). Трехэлектродная ячейка, подсоединяемая к потен-циостату, содержала рабочий электрод, хлоридсе-ребряный электрод сравнения (в 1 M KCl) и платиновый вспомогательный электрод.
Проточно-инжекционная система состояла из перистальтического насоса Macroflex (LKB Bromma, Швеция) и инжектора с объемом пробы 200 мкл, соединенных с проточной амперометрической
ячейкой. Входное отверстие ячейки было снабжено хлоридсеребряным электродом сравнения в 0.1 М KCl. Вспомогательный электрод - трубка из нержавеющей стали, служащая выходным отверстием ячейки. Расстояние между рабочим электродом и соплом ячейки около 2 мм. Для тестирования сенсора ячейку подсоединяли к потенциостату 641 VA-Detector (Metrohm, Швейцария). Скорость потока буферного раствора 0.25 мл/мин.
Методы. Скорость окисления глюкозы под действием ГОД в смесях вода-органический растворитель и в мембранах полиэлектролита измеряли c помощью кислородного электрода Кларка: регистрировали изменение тока, пропорциональное скорости убывания кислорода в системе в ходе реакции, катализируемой ферментом. Величина базового тока при -0.6 В отн. х.с.э. пропорциональна растворимости молекулярного кислорода в буферном растворе при постоянном перемешивании и температуре 25°С, т.е. 2.5 х 10-4 М (пересчитано из [9]). Концентрация глюкозы в буфере 2 составляла 50 мМ. Для приготовления суспензий фермента в водно-органических смесях смешивали растворитель с водой, затем добавляли к исходному водному раствору фермента, и получали смеси с содержанием воды 5-30 % и концентрацией фермента 0.75 мг/м
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.