ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 51, № 3, с. 313-318
УДК 576.8:577:15.08/.082
ОПРЕДЕЛЕНИЕ КЛЕТОК Azospirillum brasilense С ПОМОЩЬЮ БАКТЕРИОФАГОВ МЕТОДОМ ЭЛЕКТРООПТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА
МИКРОБНЫХ СУСПЕНЗИЙ
© 2015 г. О. И. Гулий*, **, ***, О. А. Караваева*, С. А. Павлий****, О. И. Соколов*,
В. Д. Бунин*****, О. В. Игнатов*
*Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов, 410049
e-mail:guliy_olga@mail.ru **Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова, Саратов, 410012 ***Саратовский научно-исследовательский ветеринарный институт РАСН, Саратов, 410028 ****Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского, Саратов, 410005
*****EloSystem GbR, Берлин 13407 Поступила в редакцию 22.07.2014 г.
Изучена зависимость изменения электрооптических свойств суспензии клеток Azospirillum brasilense Sp7 при взаимодействии с бактериофагом ФАЬ-$р7 от их количества и времени. Установлено, что при инкубации клеток с бактериофагом происходит значительное изменение величины электрооптического сигнала уже через 1 мин. Изучена селективность действия бактериофага ФАЬ-$р7 по отношению к 18 штаммам бактерий рода Azospirillum: A. amazonense Am14, A. brasilense Sp7, Cd, Sp107, Sp245, Jm6B2, Br14, KR77, S17, S27, SR55, SR75, A. halopraeferans Au4, A. irakense KBC1, KA3, A. lipoferum Sp59b, SR65 и RG20a. Установлен предел достоверного определения инфицированных бактериофагом микробных клеток, который составлял ~104 кл./мл. Показано, что присутствие посторонних клеток культур E. coli B-878 и E. coli XL-1 не затрудняло детекцию клеток A. brasilense Sp7 с использованием бактериофага ФAb-Sp7. Представленные результаты показали, что бактериофаг ФAb-Sp7 можно использовать для детекции микробных клеток азоспирилл с помощью метода электрооптического анализа клеточных суспензий.
Ключевые слова: Azospirillum brasilense, бактериофаги, электрооптический анализ. DOI: 10.7868/S0555109915030083
Важную роль в процессах азотфиксации играют грамотрицательные рост-стимулирующие бактерии рода Azospirillum. Среди азоспирилл наибольшее внимание исследователей привлекает вид Azospirillum ЬгазИвтв как модельный объект при изучении ассоциативных и эндофитных ризо-симбиозов, образуемых бактериями и высшими растениями [1—5]. Состав и численность ассоциативной микрофлоры зависит от сезонных колебаний и антропогенных воздействий. В связи с этим разработка методов, в том числе методов детекции клеток азоспирилл, позволяющих осуществлять мониторинг состава ризосферных бактерий, является одной из задач современной экологической микробиологии [6].
Вирусы бактерий, поражающие микробные клетки, могут быть использованы для детекции этих микроорганизмов. За счет рецепторов, расположенных на поверхности клетки, осуществляется узнавание и прикрепление бактериофагов к бактериальным клеткам. На этом основано большинство методов детекции микробных клеток с
использованием бактериофагов [7—8], среди которых широкое распространение получили биосенсорные методы [9—12]. В последнее время активно развиваются исследования по определению микробных клеток с использованием электрофизических методов анализа [11, 13—14]. Так, методы электрооптического анализа микробных суспензий основаны на регистрации изменения оптических свойств микробной суспензии под влиянием переменного электрического поля. Исследование основано на измерении электроповерхностных свойств клетки и клеточных структур, индуцированных электрическим полем. При взаимодействии зарядов на границе с электрическим полем меняется ориентация бактерий в окружающей среде, что приводит к изменению оптических свойств суспензии [15]. Ранее было показано, что при взаимодействии антител и вирусов с бактериальными клетками происходит изменение электрооптических (ЭО) параметров бактериальных суспензий [16-18].
Цель работы — выделение бактериофага из микробных клеток A. brasilense штамма Sp7 и его использование для детекции клеток азоспирилл с помощью метода электрооптического анализа клеточных суспензий.
МЕТОДИКА
Бактериальные штаммы и условия выращивания бактерий. В работе использовали штаммы A. brasilense Sp7, Cd, Sp107, Sp245, Jm6B2, Br14, KR77, S17, S27, SR55, SR75, A. amazonense Am14, A. halopraeferans Au4, A. irakense KBC1, KA3, A. li-poferum Sp59b, RG20a, SR65; Escherichia coli B-878 и XL-1, полученные из коллекции культур Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН. Микроорганизмы хранились при +4° С на чашках Петри с картофельным агаром (для клеток азоспирилл) и на чашках Петри с твердой питательной средой LB, содержащей 3% агар-агара (для клеток кишечной палочки). Культуры пересевались каждые 14 сут.
Для культивирования бактерий использовали жидкую питательную среду LB [19] следующего состава (г/л): NaCl — 10.0 и пептон — 5.0 ("Becton, Dickinson and Company", Франция), а также дрожжевой экстракт ("DIFCO", США) - 5.0.
Для хранения азоспирилл использовали среду следующего состава (г/л): клубни картофеля -200, агар-агар — 30.
Культуры бактерий выращивали в 250 мл колбах Эрленмейера на жидкой среде LB на круговой качалке при интенсивности перемешивания (160 об./мин) в течение 18—20 ч при 30 ± 1°С.
Выделение и характеристика бактериофагов. Выделение бактериофага проводили с использованием методики, описанной в [19]. Для стимуляции выхода бактериофагов из клеток культуру микроорганизмов охлаждали до +4°С в течение 1.5—2 ч, а затем клетки отделяли центрифугированием при 2500 g в течение 40 мин. К суперна-танту добавляли 1/5 объема 20%-ного раствора полиэтиленгликоля (PEG6000, "Panreac", Испания), содержавшего 1.6 М NaCl (ПЭГ^О), и охлаждали до 4°С в течение 2 ч. Выпавший осадок отделяли центрифугированием при 12000 g в течение 30 мин и высушивали в течение 30 мин. Осадок суспендировали в 1 мл 10мМ трис-HCl-буфера, рН 7.5—8.0, содержавшего 1мМ ЭДТА, (ТЕ-буфер), и нерастворившуюся его часть удаляли центрифугированием при 10000 g в течение 5 мин. К супернатанту в стерильных условиях добавляли 0.2 мл ПЭГ№0, образовавшийся осадок отделяли центрифугированием при 6500 g в течение 5 мин и растворяли в 1 мл ТЕ-буфера. Суспензию бактериофага хранили при —4°С.
Определение количества фаговых частиц. Количество фаговых частиц определяли спектрофото-
метрически на приборе Specord BS-250 ("Analytik Jena", Германия) в кювете 1 мм.
Подготовка клеток к электрооптическому анализу.
Для электрооптического анализа клетки трехкратно промывали дистиллированной водой с последующим центрифугированием при 2800 g в течение 5 мин, а затем ресуспендировали в небольшом объеме воды (электропроводность 1.6 ^S/см) и центрифугировали при 110 g в течение 1 мин для удаления конгломератов. Полученную бактериальную суспензию клеток в надосадочной жидкости разбавляли дистиллированной водой до значений оптической плотности при 670 нм, равным 0.4, что соответствовало концентрации 4.5 х 108 кл./мл.
Проведение электрооптического анализа клеточных суспензий. Измерение ориентационных спектров (ОС) клеток проводили на электрооптическом анализаторе ELUS ("Государственный научный центр прикладной микробиологии", Россия) с дискретным набором частот ориентирующего электрического поля (740, 1000, 1450, 2000 и 2800 кГц) [20] при 670 нм, напряженности электрического поля 17 В/см, времени его приложения 16 с. Длина оптического пути электрооптической ячейки составляла 8 мм, объем — 1 мл, концентрация клеток — 4.5 х 108 кл./мл. Количество клеток определяли стандартным методом с использованием светового микроскопа Ergaval ("Carl Zeiss", Германия).
Ориентационный спектр представлялся в виде зависимости разности значений оптической плотности суспензий (SOD) при 670 нм от частоты воздействующего электрического поля при распространении пучка неполяризованного света вдоль и поперек направления ориентирующего поля. Эта разность была нормирована по значению оптической плотности при 670 нм для хаотически ориентированных клеток. Для измерений использовались относительные единицы, которые с точностью до константы, равной примерно 1—5 х 10-32, соответствовали анизотропии поляризуемости частиц с размерностью Ф/m2.
Все анализы проводились, по крайней мере, в пяти повторностях, и результаты представлены в виде средних значений, полученных с указанием стандартного отклонения. Относительная погрешность результатов измерений стандартных образцов составляла ±3%.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Сведения о бактериофагах бактерий рода Azospirillum ограничены. Первые работы по выделению бактериофагов из клеток Azospirillum были опубликованы еще в 80-х годах XX столетия [21—23]. В дальнейшем было описано выделение и исследование бактериофагов из 24 штаммов 4 видов бактерий, принадлежащих к роду Azospi-
rillum [24], в частности, бактериофаг из микробных клеток A. brasilense Sp7. Микробные клетки этого штамма были использованы в данной работе для выделения бактериофага ФАЬ^р7.
Оптимизация условий измерения ЭО параметров суспензии клеток A. brasilense Sp7 включала выбор условий времени приложения электрического поля, его напряжения и частоты. Было выбрано напряжение электрического поля, равное 17 В/см, при времени его приложения 16 с и частотах 740, 1000, 1450, 2000 и 2800 кГц.
Изучение динамики изменений величины ЭО сигнала суспензии клеток A. brasilense Sp7 при инфицировании бактериофагом ФАЬ^р7 (20 бактериофагов на бактерию) показало, что происходит изменение величины ЭО сигнала. В дальнейших экспериментах были использованы те же условия.
В суспензию клеток A. brasilense Sp7 (108 кл./мл) вносили бактериофаг и инкубировали в течение 1, 5, 10, 20 и 30 мин при 37°С. Электропроводность воды во всех случаях составляла 1.6 ^S/m. При инфицировании клеток A. brasilense Sp7 бактериофагом ФАЬ^р7 наблюдали изменение величины ЭО сигнала через 1 мин, что, вероятно, связано с адсорбцией бактериофага на поверхности клетки. При продолжении воздействия бактериофага величина этого сигнала изменялась незначительно (рис. 1а, б).
Одним из важных параметров метода детекции клеток является определение минимального количества детекти
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.