научная статья по теме ОПРЕДЕЛЕНИЕ МИНИМАЛЬНОГО ЦИНК-СВЯЗЫВАЮЩЕГО ЦЕНТРА ПРИРОДНЫХ ИЗОФОРМ ДОМЕНА 1–16 БЕТА-АМИЛОИДА МЕТОДОМ ESI-MS Биология

Текст научной статьи на тему «ОПРЕДЕЛЕНИЕ МИНИМАЛЬНОГО ЦИНК-СВЯЗЫВАЮЩЕГО ЦЕНТРА ПРИРОДНЫХ ИЗОФОРМ ДОМЕНА 1–16 БЕТА-АМИЛОИДА МЕТОДОМ ESI-MS»

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2013, том 47, № 3, с. 498-504

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ^^^^^^^^ БИОПОЛИМЕРОВ И ИХ КОМПЛЕКСОВ

УДК 577.29

ОПРЕДЕЛЕНИЕ МИНИМАЛЬНОГО ЦИНК-СВЯЗЫВАЮЩЕГО ЦЕНТРА ПРИРОДНЫХ ИЗОФОРМ ДОМЕНА 1-16 БЕТА-АМИЛОИДА

МЕТОДОМ ESI-MS

© 2013 г. И. А. Попов1, 2, 3, 4, 5, М. И. Индейкина1, 2, 3, А. С. Кононихин1, 3, Н. Л. Стародубцева1, С. А. Козин2* 5*, А. А. Макаров2, Е. Н. Николаев1* 3* 4* 5

Институт энергетических проблем химической физики им. В.Л. Тальрозе Российской академии наук, Москва, 119334 2Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук, Москва, 119991 3Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук, Москва, 119334 4 Московский физико-технический институт (государственный университет), Москва, 117303 5Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича Российской академии

медицинских наук, Москва, 119334 Поступила в редакцию 10.10.2012 г.

Принята к печати 16.10.2012 г.

Болезнь Альцгеймера - смертельная нейродегенеративная патология, сопровождающаяся образованием водорастворимых нейротоксичных олигомеров бета-амилоида Ар человека, которые затем накапливаются в виде полимерных внеклеточных агрегатов (так называемых амилоидных бляшек). Изомеризованная по ас-партату 7 изоформа Ар человека (isoAp) - основной компонент амилоидных бляшек, и ее рассматривают в качестве потенциального патогенного агента болезни Альцгеймера. При этом существует вероятный механизм образования этой изоформы из генетически обусловленного варианта бета-амилоида D7N (мутация Тоттори). Напротив, Ар крысы/мыши (ratA|i), который по сравнению с Ар человека имеет три аминокислотные замены в металл-связывающем домене 1-16, не подвержен патогенной агрегации in vivo в отличие от других известных генетически обусловленных или химически модифицированных природных изоформ Ар. Взаимодействие с ионами цинка играет критическую роль в агрегации мономерного Ар человека in vitro и in vivo. В настоящей работе с использованием метода масс-спектрометрии ESI-MS высокого разрешения впервые показано, что домены 1-16 изоформ isoAp и D7NAp связывают ион цинка так же, как и домен 1-16 Ар человека. В то же время структура минимального цинк-связывающего центра ratAp существенно отличается. Полученные результаты подтверждают общий механизм взаимодействия ионов цинка с изоформами бета-амилоида человека и позволяют предположить, что модуляция структуры участка 6-14 бета-амилоида может быть использована в качестве перспективного терапевтического подхода для лечения болезни Альцгеймера.

Ключевые слова: структура, механизм, хелатирование, масс-спектрометрия, бета-амилоид, цинк.

IDENTIFICATION OF THE MINIMAL ZINC-BINDING CENTER IN NATURAL ISOFORMS OF AMYLOID-BETA DOMAIN 1-16 USING ESI-MS, by I. A. Popov1'3'4'5, M. I. Indeykina1'2'3, A. S. Kononikhin1'3' N. L. Starodubtseva1' S. A. Kozin2'5* A. A. Makarov2' E. N. Nikolaev1'3'4'5(1Tal'roze Institute for Energy Problems of Chemical Physics, Russian Academy of Sciences, Moscow, 119334 Russia; 2Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences, Moscow, 119991Russia, *e-mail: kozinsa@gmail.com; 3Emanuel Institute of Biochemical Physics, Russian Academy of Sciences, Moscow, 119334 Russia; 4Moscow Institute of Physics and Technology (State University), Moscow, 117303 Russia; 5Orekhovich Institute of Biomedical Chemistry, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow, 119334 Russia). Alzheimer's disease, is a lethal neurodegenerative pathology, characterized by the formation of soluble neurotoxic oligomers of the human amyloid-beta peptide Ap, which get accumulated forming polymeric extracellular aggregates (so-called amyloid plaques). The isomerized at aspartate 7 isoform of the human Ap (isoAp) is the main component of these plaques and is considered as the potential pathogenic agent of AD. Besides this, there is a possible generation mechanism for this isoform from a genetically deficient D7N Ap variant (Tottori mutation). On the contrary the rodent Ap (rat Ap), which has three amino acid substitutions in its metal-binding domain, is not susceptible to pathogenic aggregation in vivo' unlike the other known natural isoforms of Ap. In-

Принятые сокращения: БА — болезнь Альцгеймера; ЯМР — ядерный магнитный резонанс; AP — бета-амилоид; CID — collision induced dissociation — столкновительная фрагментация (фрагментация ионов в столкновениях с нейтралями); D7NAP — бета-амилоид человека, содержащий точечную мутацию D7N; ECD — electron capture dissociation — фрагментация при захвате электрона; isoAp — изомеризованная по аспартату 7 изоформа бета-амилоида человека; MS/MS — двойная масс-спектрометрия; ESI — электроспрейная ионизация; ratAP — бета-амилоид крысы/мыши.

* Эл. почта: kozinsa@gmail.com

teractions with zinc ions play a crucial role in the aggregation of monomeric human Ap in vitro and in vivo. In the presented article using high resolution ESI-MS methods it was shown that domains 1—16 of isoAp and D7NAp bind zinc ions in the exactly the same manner as the normal human Api—16, whereas ratAp has significant differences in structure of its minimal zinc binding center. These results confirm the overall interaction mechanism between zinc ions and the humanAp isoforms and allows to suppose that perhaps modulation of the structure of region 6—14 of Ap can be used as a promising therapeutic approach to Ad treatment.

Keywords: structure, mechanism, chelation, mass-spectrometry, amyloid-beta, zinc. DOI: 10.7868/S0026898413020122

ВВЕДЕНИЕ

Согласно общепринятой амилоидной гипотезе возникновения болезни Альцгеймера (БА) избыточное накопление бета-амилоида (AP) в тканях мозга в виде внеклеточных надмолекулярных ансамблей - амилоидных бляшек - главная молекулярная причина этой нейродегенеративной патологии человека и большинства других видов млекопитающих [1]. Однако движущие силы структурного перехода Ар из физиологически нормального мономерного состояния в димеры и далее в олигомеры, которые в итоге формируют амилоидные бляшки, остаются неизвестными [2].

Ключом к пониманию механизма возникновения БА может быть анализ влияния отдельных аминокислотных остатков на структурно-функциональные свойства Ар. Действительно, одни природные варианты Ар, включая Ар человека, а также его изомеризованную по аспартату 7 изо-форму (isoAP), накапливаются in vivo в виде амилоидных бляшек и таким образом участвуют в патогенезе болезни Альцгеймера [3], в то время как другие (бета-амилоид крысы/мыши, ratAP), отличающийся от Ар остальных млекопитающих тремя аминокислотными заменами R5G, Y10F и H14R), никогда таких бляшек не образует, и эти грызуны не подвержены данному заболеванию [4-5]. Важно отметить: что существует генетически обусловленный вариант бета-амилоида с заменой D7N, так называемой мутацией Тоттори, который ассоциирован с наследственной формой болезни Альцгеймера [6] и является наиболее вероятным предшественником изомеризованной формы, так как аспарагин очень легко может превратиться в изоаспарат [3]. Ионы цинка играют критическую роль в олигомеризации и последующей агрегации Ар человека [7]. Многочисленные попытки определить молекулярный механизм образования цинк-индуцированных димеров и олигомеров из мономерных форм Ар оказались безуспешными, так как спонтанная агрегация Ар не позволяет достоверно определять структурно-функциональные характеристики исследуемого процесса. Однако при использовании коротких синтетических аналогов Ар обнаружили, что в связывании ионов цинка главную роль играет аминокислотный участок 1-16 А0 [8-9], который позднее идентифицировали как металл-связыва-

ющий домен Лр для всех млекопитающих [10]. Недавно предположили, что именно этот домен контролирует цинк-зависимую димеризацию на-тивной изоформы Лр человека за счет образования специфических нековалентных связей между аминокислотными остатками взаимодействующих молекул в присутствии ионов цинка [7].

Для Лр человека ранее определен молекулярный механизм взаимодействий с ионами цинка, согласно которому один ион этого металла вначале хелатируется боковыми группами аминокислотных остатков Е11, Н13 и Н14, а четвертую координационную связь занимает молекула воды, которая впоследствии замещается боковой группой остатка Н6 [11]. Установлено, что участок 6-14 -минимальный цинк-связывающий центр Лр человека. С помощью спектроскопии ЯМР и изотермической калориметрии титрования показано, что синтетический пептид, соответствующий домену 1—16 га1Лр, образует с ионом цинка устойчивый межмолекулярный комплекс в соотношении 2 : 1, а фрагмент 6-14 образует структурное ядро цинк-связанного димера Лр крысы/мыши [12]. Молекулярный механизм образования такого димера наиболее вероятно должен включать образование комплекса [пептид] : [ион цинка] (1 : 1), однако экспериментальных данных о свойствах такого комплекса в настоящее время нет. В то же время, с помощью метода масс-спектрометрии показано, что домен 1-16 изомеризованной по аспартату 7 изформы Лр человека ^оЛР), выделенной из амилоидных бляшек пациентов с диагнозом болезни Альцгеймера [13], формирует цинк-инду-цированные димеры в условиях, при которых домен 1-16 нативного Лр остается в мономерном состоянии [14]. Эти данные подтвердили участие ионов цинка в патогенезе БА и обосновали потенциальную роль 1боЛР в качестве патогенного агента этого заболевания. Таким образом, сравнение цинк-связывающих свойств домена 1-16 нативного Лр человека, Лр крысы/мыши, а также изомеризованного по аспартату 7 Лр человека могло бы дать представление о физиологическом и патогенном взаимодействиях ионов цинка с Лр.

В настоящей работе структуры минимального цинк-связывающего центра каждой из вышеупомянутых природных изоформ Лр (Лр человека, 1болР , Э7МЛр и га1ЛР) определены с использова-

нием модернизированного методологического подхода на основе масс-спектрометрии высокого разрешения, который ранее эффективно использовали при изучении комплексов домена 1-16 натив-ного Лр человека с катионами переходных металлов [15]. В этом по

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком