ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ =
УДК 543.42
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПАРАМЕТРОВ МОЛЕКУЛЯРНО-МАССОВОГО РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ГИДРОКСИЭТИЛКРАХМАЛОВ МЕТОДОМ ДИФФУЗИОННО-УПОРЯДОЧЕННОЙ СПЕКТРОСКОПИИ ЯМР © 2015 г. Н. Е. Кузьмина, С. В. Моисеев1, В. И. Крылов, В. А. Яшкир, В. А. Меркулов
Научный центр экспертизы средств медицинского применения Минздрава России 127051 Москва, Петровский бульвар, 8 1Е-таИ: MoiseevSV@expmed.ru Поступила в редакцию 26.12.2013 г., после доработки 27.10.2014 г.
Исследована возможность применения метода диффузионно-упорядоченной спектроскопии ЯМР для изучения молекулярно-массового распределения гидроксиэтилкрахмалов. Для количественной оценки средневесовой (М№), среднечисловой (Мп) молекулярных масс, молекулярной массы в максимуме пика (Мр) предложено использовать уравнения регрессии, связывающие эти параметры с коэффициентами самодиффузии макромолекул полимера как единого целого — среднего коэффициента самодиффузии Д и коэффициента самодиффузии в максимуме пика Др. Показано, что определение М№, Мп, Мр на основе данных о Д. приводит к лучшим результатам. Установлено, что значения индексов полидисперсности, определенные методом диффузионно-упорядоченной спектроскопии ЯМР, не зависят от выбора диффузионного параметра Д. или Др.
Ключевые слова: диффузионно-упорядоченная спектроскопия ЯМР, параметры молекулярно-мас-сового распределения полимеров, средний коэффициент самодиффузии, коэффициент самодиффузии в максимуме пика, гидроксиэтилкрахмалы.
Б01: 10.7868/80044450215070075
Гидроксиэтилкрахмалы (ГЭК) являются эффективными плазмозамещающими средствами инфузи-онной терапии, основной функцией которых является восполнение внутрисосудистого объема жидкости [1, 2]. Молекулярная структура ГЭК представляет
собой полидисперсный разветвленный амилопек-тин — полимер а-Д-глюкопиранозы с замещенными гидроксиэтильными группами. Линейная часть макромолекул ГЭК содержит а (1 —- 4) связи, разветвления — главным образом а (1 —► 6) связи (схема).
НО
О
2
о . о
ОН
О| О.
ОН
Схема. Фрагмент молекулярной структуры ГЭК: связь а (1 ^ 4) (1), связь а (1 ^ 6) (2) [3, 4].
1
Крахмалы натурального происхождения не могут использоваться в качестве плазмозамещаю-щих средств, так как быстро гидролизуются под действием амилазы. Замещенные гидроксиэтиль-ные группы в молекуле ГЭК обеспечивают замедление гидролиза и соответственно метаболическую деградацию и элиминацию препаратов из кровотока [5]. Физико-химические свойства, метаболизм и экскреция ГЭК зависят не только от свойств, приобретенных в результате гидрокси-этилирования крахмала, но и от их молекулярно-массового распределения (ММР). При введении полидисперсного коллоидного раствора ГЭК в систему кровообращения малые молекулы, размеры которых ниже величины почечного порога (45—60 кДа), быстро выводятся, в то время как более крупные молекулы остаются в системе кровообращения в течение длительного времени, которое зависит от их размеров и скорости распада [1]. Поэтому определение ММР является обязательной задачей фармакопейного анализа качества лекарственных субстанций ГЭК [6].
Основными параметрами ММР полимеров являются средняя молекулярная масса (ММ) и индекс полидисперсности, отражающий статистическую ширину ММР Средняя ММ представленных на рынке препаратов на основе ГЭК находится в диапазоне 70—670 кДа [7]. В зависимости от способа усреднения различают средневесовую молекулярную массу М„ (усреднение по массе макромолекул в полимере) и среднечисловую молекулярную массу Мп (усреднение по числу макромолекул в полимере). Величина Мж чувствительна к высокомолекулярным фракциям, а Мп — к низкомолекулярным фракциям полидисперсных полимеров. Поэтому для характеристики средней ММ полимеров часто используют молекулярную массу в максимуме хроматографического пика Мр, которая для узкодисперсных образцов, характеризующихся близкими значениями ММ макромолекул, равна Мр = = (М№ х Мп)0 5 [8]. Отношение Мж/Мп определяет индекс полидисперсности полимера, позволяющий оценить разброс макромолекул по молекулярным массам и определить число единиц ветвления в разветвленной макромолекуле полимера [8]. Снижение индекса полидисперсности ГЭК улучшает фармакокинетику препарата и уменьшает его воздействие на реологические свойства крови после инфузии [9].
В настоящее время наиболее надежным методом определения средних ММ и индекса полидисперсности полимеров является метод мульти-детекторной гель-проникающей хроматографии (ГПХ) [10]. ГПХ с детектором по светорассеянию и концентрационным детектором с вискозиметром позволяет находить молекулярные массы независимо от способа градуировки колонок. В последнее десятилетие получил развитие новый перспектив-
ный метод определения средней ММ полимеров — метод диффузионно-упорядоченной спектроскопии ЯМР (diffusion ordered spectroscopy, DOSY), позволяющий измерить самодиффузию различных молекулярных объектов (молекул, макромолекул, молекулярных комплексов, супрамолекулярных систем) при использовании градиента магнитного поля [11]. Метод DOSY основан на регистрации потери фазовой когерентности ядерных спинов за счет трансляционных перемещений молекул в таком поле [12, 13]. Диффузную информацию используют для количественной оценки размера макромолекул полимера и соответственно его молекулярной массы [14—20]. Преимуществом метода DOSY является получение наряду с диффузной также спектральной информации (значения химических сдвигов, мультиплетность сигналов), что позволяет в рамках одного эксперимента решить целый спектр задач фармакопейного анализа качества лекарственных субстанций ГЭК: подтверждение подлинности, количественное определение молярного замещения (отношение количества гид-роксиэтильных групп к общему количеству молекул глюкозы) и соотношение С2/С6 (отношение количества гидроксиэтильных групп, расположенных у второго атома углерода, к количеству гидрокси-этильных групп, расположенных у шестого атома углерода в глюкопиранозном цикле).
Метод DOSY предусматривает нахождение градуировочной зависимости параметра ММР от коэффициента самодиффузии D (количественной характеристики диффузных процессов) в ряду объектов, близких по природе к исследуемой системе, с последующей экстраполяцией полученной зависимости на значение D изучаемого объекта. При нахождении корреляционного уравнения очень важна проблема корректной интерпретации данных DOSY эксперимента, поскольку определение значения D полимера как единого целого — нетривиальная задача, даже если все инструментальные источники погрешностей учтены, и значения D скорректированы. Основная трудность связана с тем, что не все ядра полимерной макромолекулы характеризуются одним значением D.
Цель работы состояла в сравнении различных способов определения значения коэффициента самодиффузии D макромолекул ГЭК как единого целого и нахождения функциональной зависимости между основными параметрами ММР ГЭК и D.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В качестве объектов исследования использовали стандартные образцы ГЭК (American polymer standards corporation, США). Их параметры ММР представлены в табл. 1. Регистрацию спектров 1Н и 1H-DOSY проводили на ЯМР спектрометре Agilent DD2 NMR System 600 с 5-мм инверсным мультиядерным датчиком, оснащенным
Таблица 1. Значения параметров ММР (кДа) исследовавшихся образцов ГЭК
Образец Mp Mw Mn Образец Mp Mw Mn
HETA 6 5.5 6.0 4.0 HETA 9 8.9 9.4 5.6
HETA 18 16.1 18.3 13.0 HETA 60 52.8 59.7 38.1
HETA 88 80.0 88.0 55.1 HETA 130 121.1 130.6 78.4
HETA 160 153.6 159.2 85.9 HETA 175 176.1 206.5 88.9
HETA 230 201.0 229.0 113.8 HETA 250 219.3 250.4 130.5
HETA 337 374.0 337.6 162.6 HETA 380 330.2 379.8 178.6
НЕТА 460 396.9 459.4 188.5 НЕТА 600 468.7 608.1 288.0
НЕТА 1300 1004.0 1312.0 690.3
градиентной катушкой, при 300 К. Анализируемые пробы в количестве 5 мг растворяли в 0.5 мл D2O (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.). Полученные растворы разбавляли D2O в 10 раз до концентрации 1 мг/мл и переносили в ЯМР-ампулы Shigemi со стеклянным плунжером для минимизации эффектов конвекции и неоднородности импульсов градиента магнитного поля. Для измерения коэффициентов самодиффузии использовали последовательность DBPPSTE (DOSY bipolar pulse pair stimulated echo) [21]. Кривые диффузионного затухания получали при последовательном 15-шаговом линейном увеличении амплитуды импульса градиента магнитного поля в интервале 1.82—53 1с/см при фиксированных для всех ГЭК значениях времени диффузии А = 285 мс, длительности градиентного импульса 8имп = 2.0 мс и времени релаксации d1 = 5 с. Математическую обработку результатов осуществляли методом DISCRETE (discrete sum of exponential decays) [22], в рамках которого каждую кривую диффузионного затухания двухкомпонентной смеси вода—ГЭК представляли суммой двух экспоненциальных составляющих. Вывод корреляционных уравнений и расчет статистических параметров (коэффициентов детерминации, фактических и табличных значений /-критериев Фишера, í-критериев Стьюдента) выполняли с использованием программного обеспечения MS Excel 2007 при уровне значимости P = 0.05 и численности выборки n = 12.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Под самодиффузией понимают пространственное перемещение молекул в термодинамически равновесной материальной среде за счет хаотического теплового движения [23]. Самодиффузию характеризуют коэффициентом самодиффузии Д, который численно равен среднеквадратичному смещению молекулы за время диффузии 4. Информацию о ве-
личине Д молекулярной системы в рамках метода DOSY получают из анализа диффузионного затухания — зависимости амплитуды сигнала спинового эха от параметров градиента магнитного поля, которая описывается функцией Стейскала—Таннера [24]:
Д5имп, А) = /оехр[-Ду2^28имп2(А - 5^3)],
где I и 10 — амплитуды сигнала спинового эха в присутствии и отсутствие импульса градиента магнитного поля; А — время диффузии, мс; 5имп — длительность градиентного импульса, мс; у — гиромагнитное отношение для данного ядра, Гц Тл-1; g — величина градиента магнитного поля, Тл м—1.
Зависимость величины Д от размера молекулярных объектов описывает, как известно, уравнение Стокса—Эйнште
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.