ХИМИЧЕСКАЯ ФИЗИКА БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ
УДК 535.372.3; 538.958
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПАРАМЕТРОВ ВРАЩАТЕЛЬНОЙ ДИФФУЗИИ КОМПЛЕКСОВ СЫВОРОТОЧНЫХ АЛЬБУМИНОВ С ТРИТОНОМ Х-100 ПО АНАЛИЗУ ПОЛЯРИЗОВАННОЙ ТРИПТОФАНОВОЙ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ © 2013 г. И. М. Власова*, В. В. Журавлева, А. М. Салецкий
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова *Е-таП: vlasovairina1979@mail.ru Поступила в редакцию 12.09.2012
Исследована вращательная диффузия комплексов сывороточных альбуминов — сывороточного альбумина человека (САЧ) и бычьего сывороточного альбумина (БСА) — с нейтральным детергентом Тритоном Х-100, и по анализу поляризованной триптофановой флуоресценции определены ее параметры (время вращательной релаксации, коэффициент диффузии, эффективный радиус). Обнаружены общие черты в солюбилизации обоих белков: эффективная солюбилизация САЧ и БСА в растворах нейтрального детергента Тритона Х-100 достигается при концентрации последнего 0.3 мМ, незначительно большей его критической концентрации мицеллобразования (0.25 мМ), при этом наиболее значительный эффект имеет место при рН 5.0, находящемся вблизи изоэлектриче-ских точек белков.
Ключевые слова: триптофановая флуоресценция, сывороточный альбумин человека, бычий сывороточный альбумин, солюбилизация, вращательная диффузия.
Б01: 10.7868/80207401X13100105
ВВЕДЕНИЕ
В данной работе исследуется вращательная диффузия комплексов сывороточных альбуминов — сывороточного альбумина человека (САЧ) и бычьего сывороточного альбумина (БСА) — с солюбилизи-рующим их нейтральным детергентом Тритоном Х-100. Комплексы БСА и САЧ — глобулярные белки семейства альбуминов, изоэлектрическая со следующими характеристиками: точка БСА — р1 4.9 и САЧ — р1 4.7, молекулярная масса БСА — 64 кДа и САЧ — 66.4 кДа [1]. Сывороточные альбумины представляют собой белки плазмы крови. Способность их молекул связывать обширный круг ли-гандов определяет одну из основных функций этих белков — перенос физиологических метаболитов.
Первичная структура сывороточных альбуминов определяется единственной полипептидной цепью каждого из белков, состоящей из 585 (САЧ) и 582 (БСА) аминокислотных остатков. Третичная структура обоих белков (САЧ и БСА) определяется тремя доменами. Оба белка являются типичными представителями белков семейства альбуминов и имеют схожее строение с небольшими различиями. В частности, в отличие от САЧ, имеющего один остаток триптофана (Тгр 214), БСА
имеет в своей аминокислотной цепи два остатка триптофана — Тгр 135 и Тгр 214.
В исследовании белков широко применяются детергенты, как ионные, так и нейтральные [2—4]. Нейтральные детергенты используют для выделения интегральных мембранных белков и получения их в активной биохимической форме, а также для перевода глобулярных водорастворимых белков из водной среды в липидную: для этой цели необходимы детергенты, позволяющие солюби-лизовать белки и сохранить их в растворе.
При солюбилизации происходит комплексо-образование молекул белка (за счет его гидрофобных участков) и мицелл детергента. Основная проблема в вопросах солюбилизации белков — это подбор оптимальных условий солюбилизации исследуемого белка. Ионные детергенты, денатурирующие белки, не подходят для решения такой деликатной задачи. Для солюбилизации нужны такие детергенты, которые не нарушали бы вторичную и третичную структуры белка, а лишь связывались с гидрофобными участками белковой молекулы. Для солюбилизации белков необходимо учитывать заряд детергента (лучше использовать нейтральный детергент), его ККМ (критическую концентрацию мицеллообразова-
Р а б
Концентрация Тритона Х-100, мМ
Рис. 1. Зависимость степени поляризации Р триптофановой флуоресценции (^возд = 295 нм) 5 мкМ САЧ (а) и 5 мкМ БСА (б) от концентрации Тритона Х-100 в растворах с различными значениями рН: 3.5 (1), 4.0 (2), 4.5 (3), 5.0 (4), 5.5 (5), 6.0 (б), 6.5 (7), 7.0 (8), 7.5 (9), 8.0 (10).
ния) и размер мицелл детергента. Нейтральные детергенты в основном солюбилизируют белки, не повреждая их. Среди детергентов, часто применяющихся в биохимических, медицинских и фармацевтических исследованиях для солюбили-зации белков, можно выделить [4] нейтральный детергент Тритон Х-100 (ККМ — 0.25 мМ, агрега-ционное число — 140).
Цель данной работы — исследование взаимодействия сывороточных альбуминов (САЧ и БСА) с нейтральным детергентом Тритоном Х-100, сопровождающегося образованием комплексов белок—детергент, проведенное по оценке параметров вращательной диффузии комплексов, определенных из анализа поляризованной триптофановой флуоресценции САЧ и БСА. Исследование триптофановой собственной флуоресценции белков широко применяется для оценки структурного состояния белковых молекул и анализа их взаимодействия с различными лигандами [5—15], так как флуоресцентные свойства триптофановых остатков в молекулах белков весьма чувствительны к перестройкам белковых глобул при взаимодействии их с лигандами.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Растворы 5 мкМ САЧ (НПО "Микроген", Россия) и 5 мкМ БСА ("Sigma") приготовлены в двух буферных системах: 0.1 М CH3COOH - KOH (pH 3.5-5.0) и 0.1 М KH2PO4- 0.1 М NaOH (pH 5.5-8.0). К растворам САЧ и БСА добавлены различные концентрации Тритона Х-100 (0.10.7 мМ) при различных значениях pH (3.5-8.0). Для варьирования вязкости в итоговые растворы
добавлены различные концентрации сахарозы (10-200 мМ).
Флуоресцентные исследования проводились на спектрофлуориметре Perkin Elmer LS55 при комнатной температуре. Триптофановая флуоресценция САЧ и БСА регистрировалась в диапазоне 300-500 нм при возбуждении светом с длиной волны ^возб = 295 нм.
Степень поляризации P триптофановой флуоресценции САЧ и БСА рассчитывалась по значениям I\\ и I± в максимуме спектра испускания флуоресценции белков, где I \ \ и I± - интенсивности свечений, поляризованных по двум взаимно перпендикулярным направлениям. Спектры флуоресценции обрабатывались с использованием программы Perkin Elmer FL Winlab.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Проведены исследования поляризованной триптофановой флуоресценции САЧ и БСА в растворах с различными концентрациями Тритона Х-100 при различных значениях pH. Получены зависимости степени поляризации (P) триптофа-новой флуоресценции САЧ (рис. 1а) и БСА (рис. 1б) от концентрации Тритона Х-100 для различных значений pH (в отсутствие сахарозы).
Изменения поляризации флуоресценции обуславливаются вращательной диффузией флуоро-форов и безызлучательным переносом энергии между флуорофорами. Благодаря подбору экспериментальных условий (исследованы сильно разведенные растворы белков) на поляризацию флуоресценции триптофана САЧ и триптофанов БСА
Таблица 1. Коэффициент вращательной диффузии (106 с 1) комплексов САЧ с Тритоном Х-100
в растворах с различными значениями рН
Концентрация
pH
Тритона X-100, мМ 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0
0 3.69 3.25 2.74 2.54 2.74 3.78 3.72 3.35 3.51 3.42
0.1 1.86 1.65 1.57 1.46 1.54 1.68 1.81 1.86 1.89 1.96
0.2 1.77 1.69 1.53 1.42 1.51 1.70 1.76 1.80 1.86 1.88
0.3 0.40 0.39 0.36 0.32 0.35 0.39 0.40 0.42 0.43 0.44
0.5 0.37 0.36 0.34 0.31 0.34 0.36 0.37 0.40 0.40 0.40
0.7 0.36 0.34 0.32 0.30 0.32 0.34 0.35 0.36 0.37 0.37
оказывает влияние только вращательная диффузия триптофанового остатка/остатков молекулы белка, а не безызлучательный перенос энергии между флуорофорами.
Поляризация флуоресценции одного триптофанового остатка САЧ и двух триптофановых остатков БСА в общем случае обусловлена вращением как целых молекул белков, так и доменов белков, содержащих триптофановые остатки, а также вращением одного триптофанового остатка САЧ и двух триптофановых остатков БСА относительного своего ближайшего окружения. Проведенные в данной работе стационарные измерения поляризованной флуоресценции САЧ и БСА позволяют анализировать вращение целых молекул белков, а вклад относительного вращения доменов, содержащих триптофановые остатки, и вращения одного триптофанового остатка САЧ и двух триптофановых остатков БСА относительно ближайшего окружения считается пренебрежимо малым.
Видно (рис. 1), что в растворах с Тритоном Х-100 значения степени поляризации триптофановой флуоресценции САЧ и БСА возрастают по сравнению с растворами без детергента при всех значениях рН, что говорит о комплексообразовании молекул белков с Тритоном Х-100. Для исследования взаимодействия и комплексообразования САЧ и БСА с Тритоном Х-100 при различных концентрациях детергента в растворах и различных значениях рН были оценены параметры вращательной диффузии белков в растворах с детергентом с помощью метода поляризованной флуоресценции.
Количественная теория вращательной деполяризации была предложена В.Л. Левшиным и Ф. Перреном. Они использовали модель вращательной диффузии, на основе которой было получено выражение для степени поляризации Р флуоресценции [5]:
1 = 1 + (1 -1] To p р u у vn '
где T — абсолютная температура, п — вязкость раствора, V — объем, к — постоянная Больцмана, т0 — среднее время затухания флуоресценции, P0 — предельная степень поляризации флуоресценции.
Таким образом, изменяя вязкость растворов (посредством добавления различных концентраций сахарозы) и откладывая по оси ординат 1/P, а по оси абсцисс — T/п, получаем прямую линию, которая отсекает на оси ординат отрезок, равный 1/Р0.
Тангенс угла наклона этой прямой к оси абсцисс
tg<P = f-1 -11 ^
U V V
при известном значении т0 позволяет определить величину молекулярного объема
V =
(3 - Po)kто
З^ёФ
и, следовательно, эффективный гидродинамический радиус Эйнштейна Яф связанный с молекулярным объемом соотношением V = 4пК3//з.
Используя эти данные, можно определить время вращательной релаксации, £, (или разупорядо-чивания вследствие тепловой диффузии), по формуле 2, = Vц|Тк, где V — молекулярный объем.
Для молекулы можно определить коэффициент вращательной диффузии £вращ = кТ/ 6ц V.
Путем варьирования вязкости растворов при добавлении различных концентраций сахарозы определены время вращательной релаксации, коэффициент вращательной диффузии и эффективный радиус комплексов САЧ и БСА с Тритоном Х-100 в растворах с различными концентрациями детерген
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.