МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 73, № 1, с. 45-50
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ =
УДК 579.841.11.017.6
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОТРЕБНОСТЕЙ ДИССОЦИАНТОВ PSEUDOMONAS AERUGINOSA В УГЛЕРОДЕ, АЗОТЕ И ФОСФОРЕ
© 2004 г. П. В. Фурсова, Е. С. Милько, И. А. Ильиных, В. Н. Максимов, А. П. Левич
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова Поступила в редакцию 20.12.02 г.
В работе получены точные количественные данные о потребностях микроорганизмов, необходимые для прогнозирования поведения бактериального сообщества в зависимости от условий культивирования и управления его структурой. По данным 88 опытов по культивированию монокультур R-, S- и М-диссоциантов Pseudomonas aeruginosa определены потребности бактерий в углероде, азоте и фосфоре. В отличие от ранних исследований для каждого из диссоциантов найдены коэффициенты перевода оптической плотности культуры в количество клеток; зафиксировано достижение стационарной фазы роста; проверены изменения в диссоциативном составе культур на стационарной фазе; выявлены ресурсы, ограничивающие рост культур. Проведено сравнение полученных значений потребностей с данными других экспериментов.
Ключевые слова: диссоциация, Pseudomonas aeruginosa, потребность в основных источниках питания.
Многие бактерии, в том числе псевдомонады, в процессе роста могут расщепляться (диссоциировать) на варианты, которые различаются по физиолого-биохимическим и морфологическим признакам: по морфологии колоний, устойчивости к внешним воздействиям, способности к синтезу практически важных веществ, интенсивности разрушения ксенобиотиков и углеводородов, требовательности к содержанию питательных веществ в среде [1]. Морфологические и некоторые физиолого-био-химические свойства диссоциантов Pseudomonas aeruginosa описаны в ряде работ [2-5].
Цель настоящей работы - определение величины потребностей диссоциантов P. aeruginosa в основных компонентах питания. Количественные данные о потребностях необходимы для прогнозирования поведения бактериального сообщества в зависимости от условий культивирования и управления его структурой. Под потребностью микроорганизмов в ресурсах среды понимается потребляемое из среды количество вещества в расчете на одну образовавшуюся в процессе культивирования клетку.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В период с 1999 г. по 2001 г. были проведены 88 опытов по культивированию R-, S-, и M-диссо-циантов штамма Pseudomonas aeruginosa К-2 [2]. Бактерии выращивали на средах с различным начальным содержанием глюкозы, нитратов и фос-
фатов. Исходная среда для Я- и Б-диссоциантов содержала 2% глюкозы, 1.1% нитратов и 0.055% фосфатов, для М-диссоцианта количество веществ было уменьшено в два раза. Для изучения зависимости роста бактерий от начального содержания ресурса в среде уровень глюкозы варьировали в пределах от 0.03 до 2%, нитратов - от 0.01 до 1.1%, фосфатов - от 0.001 до 0.055%. Опыты проводили на 24 средах для каждого диссоцианта (для некоторых сред - с повторностями), причем среды составляли таким образом, чтобы один из ресурсов был лимитирующим.
Бактерии культивировали в пробирках на 50 мл с 10 мл среды на качалке (180 об/мин) при температуре 28°С в течении полутора-трех суток до достижения стационарной фазы роста. В качестве посевного материала использовали односуточные культуры диссоциантов псевдомонад, выращенных на агаризированной среде, содержащей мясопептон-ный бульон и сусло в отношении 1 : 1 (БСА). Бактерии со скошенного агара переносили петлей в пробирку с физиологическим раствором. Плотность инокулята каждого из диссоциантов во всех опытах выравнивали по нефелометру или по стандарту мутности до содержания клеток 109 в 1 мл. Посевной материал вносили в количестве 3% об.
Во время проведения эксперимента проводили измерения оптической плотности культуры, уровня кислотности, отмечали появление в монокультурах клеток других диссоциантов, а также в некоторых из опытов определяли уровень питательных веществ в среде в процессе культивирования. Пробы отбирали в начале опыта, через 14-16 ч, затем каждые 4-6 ч, пока культура не достигала
стационарной стадии. Для измерения pH среды использовали микропотенциометр Checker фирмы "HANNA Instruments". Глюкозу определяли с помощью трифенилтетразолия хлорида [6], азот - с сульфофеноловым реактивом [7], фосфор - методом Пануша [8].
Рост бактерий оценивали нефелометрически по клеточной плотности культуры. Измерения проводили на ФЭК 56 М (светофильтр № 6, зеленый, максимум пропускания 540 нм) в кювете с длиной оптического пути 0.5 см. При слабом росте бактерий использовали кювету с длиной пути 2 см, с последующим пересчетом полученных данных. Показания нефелометра для удобства расчетов умножали на 100.
Для определения количества клеток в культуре на стационарной стадии развития для каждого дис-социанта был получен коэффициент, связывающий оптическую плотность с численностью. С помощью люминесцентной микроскопии в фиксированных препаратах считали количество бактерий в суспензии известной оптической плотности. Для этого 48-часовые культуры R- и S-диссоциантов, выросших на исходной среде, разводили в 100 и 10000 раз, а 24-часовую культуру М-диссоцианта в 10 и 100 раз. Препараты просматривали на люминесцентном микроскопе ЛЮМАМ-И3 (светофильтр Ж-С-19, окуляр х 4, объектив х 90 Л). Количество микробных клеток, содержащихся в 1 мл исходной суспензии вычисляли по формуле
N = 4an х 1010, л
где N - число клеток в 1 мл исходной суспензии; a -среднее число клеток в поле зрения; S - площадь поля зрения (10000 мкм2); n - показатель разведения [9].
В результате были получены следующие коэффициенты перевода оптической плотности в количество клеток: для R-диссоцианта -108 кл/(мл ед.неф) х 100, для S-диссоцианта - 0.3 х х 108 кл/(мл ед.неф) х 100, для М-диссоцианта -0.17 х 108 кл/(мл ед.неф) х 100.
Соотношение диссоциантов в популяции определяли по морфологии колоний при рассеве клеточной суспензии на БСА.
Потребности в источниках питания рассчитывали по формуле qL = , где AL - количество
потребленного из среды вещества, L - компонент питания, An - количество вновь образовавшихся клеток за тот же период времени, индекс i характеризует диссоциант. Для расчетов средних значений потребностей и доверительных интервалов применялось стандартное приложение Microsoft Excel 7.0 (анализ - описательная статистика).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
По данным опытов, в динамике которых определяли концентрации питательных веществ, потребности рассчитывали, исходя из соответствующих измерений величин AL и Ani. В большинстве экспериментов химическое определение концентраций питательных веществ в динамике культивирования не проводили. Поэтому для определения количества потребленного ресурса, используемого при расчетах потребностей, руководствовались следующим: если остановка роста произошла по причине исчерпания некоторого питательного вещества, то количество этого ресурса, потребленного к концу роста культурой, можно считать равным его содержанию в среде в начальный момент культивирования. При этом для вычисления потребности необходимо использовать количество клеток, выросших за тот же период времени, то есть к моменту достижения стационарной фазы. Итак, для расчета потребностей необходимо выполнение следующих условий:
1. Число выросших клеток следует определять в стационарной фазе роста.
2. Остановка роста (достижение стационарной стадии) должна быть обусловлена исчерпанием в среде одного из изучаемых ресурсов.
3. Из ряда косвенных соображений, изложенных ниже, должно быть известно, какой именно ресурс полностью исчерпан, т.е. является лимитирующим.
Диктуемая названными условиями экспериментальная задача состояла в необходимости зафиксировать достижение стационарной стадии. Для этого измерения оптической плотности проводили с интервалом в несколько часов в течение двух-двух с половиной суток.
Задача анализа полученных данных состояла в выявлении лимитирующего рост ресурса. Для ее решения были применены три подхода. Первый основан на априорном представлении о том, какой питательный компонент мог бы ограничивать рост культуры на среде с заданным составом. Исходную (указанную в разделе о методике) среду, исходя из опыта культивирования P. aeruginosa, принимали за сбалансированную. А среду, где содержание некоторого ресурса было снижено по сравнению с исходной (в два и более раз), считали лимитированной по этому ресурсу. Второй путь - проверка пропорциональности оптической плотности культуры в стационарной фазе начальному количеству ресурса в среде в серии опытов с различными начальными содержаниями ресурса. При этом одна из сред в серии согласно первому подходу могла быть признана лимитирующей по рассматриваемому ресурсу. Третий подход основан на методе добавок. В некоторых опытах в предполагаемый момент достижения стационарной фазы культуру разделяли на четы-
Таблица 1. Начальный состав сред по углероду, азоту и фосфору, оптическая плотность культуры в единицах нефелометра, умноженных на 100, и уровень кислотности среды (рН) на стационарной стадии роста или в конце опыта. Символом "*" отмечены среды, при культивировании на которых применяли метод добавок
R-диссоциант S-диссоциант
номер среды содержание ресурсов в среде (мг/мл) оптическая плотность pH номер среды содержание ресурсов в среде (мг/мл) оптическая плотность pH
углерод азот фосфор (х100) углерод азот фосфор (х100)
1. 7.98 1.81 0.11 473 19*. 0.78 0.03 0.008 63 7.3
2. 4 0.9 0.056 430 20*. 0.78 0.1 0.002 30 6.6
3. 4 0.9 0.056 342 8.5 21. 0.4 0.035 0.01 30 8.4
4. 7.8 0.72 0.056 224 7.3 22. 1.62 0.14 0.04 123 8.7
5. 7.8 0.72 0.056 276 8 23. 0.4 0.015 0.01 28 7.6
6. 7.8 0.9 0.056 249 7.7 24. 1.6 0.06 0.04 136 8.8
7* 0.78 0.4 0.028 87 8.8 25. 0.12 0.035 0.01 9 7.7
8*. 3.18 0.1 0.028 89 4.1 26. 0.48 0.14 0.04 30 6.9
9*. 3.18 0.4 0.007 95 4 27. 0.12 0.015 0.01 14 8.2
10*. 0.282 0.1 0.008 21 8.4 28. 0.48 0.06 0.04 52 8
11*. 1.6 0.03 0.008 37 4.4 29. 0.78 0.1 0.01 74 8.2
12*. 1.6 0.1 0.002 26 4.1 30. 3.24 0.4 0.04 177 8.3
13. 0.4 0.035 0.01 31 8.1 31. 1.6 0.2 0.01 99 8.6
14. 1
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.