УДК 577.152.34
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОПЕПТИДОВ ЛИТИЧЕСКИХ ЭНДОПЕПТИДАЗ
А1рА И А1рВ ЬуБвЬасгег эр. ХЫ МЕТОДОМ СЭНДВИЧ-ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА НА ОСНОВЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ
© 2014 г. Н. В. Руденко*, ***, #, И. М. Цфасман**, О. Р. Латыпов**, Л. А. Ледова**, Л. А. Красовская**, А. П. Каратовская*, ***, Ф. А. Бровко*, ***,
Н. В. Васильева**, |О. А. Степная**
*Филиал ФГБУНИнститута биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН,
142290, Пущино, проспект Науки, 6 **ФГБУНИнститут биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН,
142290, Пущино проспект Науки, 5 ***Пущинский государственный естественно-научный институт, Пущино, проспект Науки, 3
Поступила в редакцию 24.07.2013 г. Принята к печати 29.10.2013 г.
Внеклеточные литические эндопептидазы А1рА и А1рВ грамотрицательной бактерии Lysobacter яр. ХЬ1 имеют высокую степень гомологии и синтезируются в виде препробелков, состоящих из сигнального пептида, пропептида и зрелой части. В данной работе получено два моноклональных антитела против пропептида эндопептидазы А1рА (РгоА) и одиннадцать против пропептида эндопептидазы А1рВ (РгоВ). Константы аффинности для антител к РгоА составляли 2.9 х 109 и 3.5 х 109 М-1, а для антител к РгоВ — от 1.5 х 108 до 2.2 х 109 М-1. Полученные антитела не обладали иммуноперекрестной реактивностью между собой, а также со зрелыми формами ферментов. На основе моноклональных антител разработан сэндвич-иммуноферментный анализ, позволяющий количественно определять эти пропептиды в растворенной нативной форме. Линейный диапазон определения РгоА составил 1.5—100.0 нг/мл с ошибкой измерения 6%, а для определения РгоВ — 0.2—6.25 нг/мл с ошибкой 6%. С помощью разработанного метода выявлены пропептиды РгоА и РгоВ в лизате клеток Lysobacter 8р. ХЬ1 в количестве 1.18 ± 0.03 и 0.096 ± 0.002 нг на 1 ОЕ540 бактериальной культуры соответственно. Иммунохимический метод определения разных форм литических эндопептидаз А1рА и А1рВ может быть полезен при решении вопросов, связанных с их секрецией в окружающую среду.
Ключевые слова: Lysobacter, эндопептидазы, секреция белков, моноклональные антитела, сэндвич-им-муноферментный анализ.
DOI: 10.7868/S0132342314030130
ВВЕДЕНИЕ
Бактерии взаимодействуют с окружающей средой с помощью гидролитических ферментов, сек-ретируемых ими за пределы клетки. Так, внеклеточные бактериолитические ферменты, разрушающие пептидогликан — основной структурный компонент клеточных стенок конкурентных бак-
Сокращения: ИФА — иммунофермениный анализ; МА — моноклональные антитела; МА-bio — биотинилированные моноклональные антитела; ОРС — открытая рамка считывания; PBS - 1 мМ KH2PO4, 9 мМ Na2HPO4, 3 мМ KCl, 140 мМ NaCl, рН 7.2; PBST - PBS, содержащий 0.1% Tween 20; ProA — пропептид эндопептидазы AlpA; ProB — пропептид эндопептидазы AlpB. 1 Автор для связи (тел.: +7 (4967) 73-37-46; эл. почта: ruden-ko@bibch.ru).
терий, — способствуют завоеванию и сохранению экологических ниш и обеспечивают питательными веществами продуцирующую их бактерию. Благодаря литическим свойствам такие ферменты являются потенциальными антимикробными агентами, использование которых в медицинской практике, в отличие от применения антибиотиков, не должно приводить к появлению резистентности. На сегодняшний день существует много вопросов относительно секреции этих белков, представляющих практическую ценность.
Грамотрицательная бактерия Lysobacter species XL1 секретирует в окружающую среду пять бакте-риолитических ферментов, обладающих разной субстратной специфичностью по отношению к пептидокликану: эндопептидазы L1 (AlpA), L4,
L5 (AlpB) разрушают пептидные связи в пептидной субъединице и межпептидных мостиках пеп-тидогликана, мурамидаза L3 разрушает связь между ^-ацетилмурамовой кислотой и ^-ацетилглюкоз-амином пептидогликана и амидаза L2 — амидную связь между лактильной группой ^-ацетилмурамо-вой кислоты и а-аминогруппой первой аминокислоты пептидной субъединицы [1—3]. Среди секре-тируемых бактериолитических ферментов L. species XL1 наиболее активны гомологичные (56% гомологии) литические эндопептидазы AlpA и AlpB, которые также гомологичны а-литической протеиназе L. enzymogenes (78 и 56% гомологии соответственно). Как и а-литическая протеиназа L. enzymogenes, ферменты AlpA и AlpB синтезируются в виде предшественников (препробелков), состоящих из сигнального пептида, пропептида и зрелой части [4, 5]. Секреция такого типа белков происходит по классической схеме в два этапа. Первый этап — это секреция синтезированной полипептидной цепи из цитозоля в периплазму. На этом этапе сигнальный пептид обеспечивает транслокацию белковых предшественников через цитоплазматическую мембрану в периплазму. После процессинга пречасти в периплазме происходит фолдинг зрелой части фермента, в котором важную роль, как предполагается, играет пропептид. Второй этап — это секреция из периплазмы в окружающую среду, которая у а-литиче-ской протеиназы L. enzymogenes предположительно происходит по системе секреции второго (II) типа [6—8]. Однако, как было нами показано ранее, литические эндопептидазы AlpA и AlpB из периплазмы в окружающую среду попадают разными путями [2]: фермент AlpB с помощью внеклеточных везикул, образуемых клетками L. species XL1, а фермент AlpA, как и а-литическая про-теиназа L. enzymogenes, через транслокационный комплекс во внешней мембране. Остается открытым ряд вопросов, связанных с пониманием про-цессинга и роли прочасти в процессе секреции этих белков из периплазмы в окружающую среду.
Наши исследования [2] позволяют предположить, что полный процессинг прочасти предшественника фермента AlpB происходит в периплазме и зрелый фермент захватывается везикулами в процессе их образования. Можно предположить, что созревание фермента AlpA происходит подобно созреванию а-литической протеиназы L. enzy-mogenes. В этом случае вопросы о том, где и когда происходит полное отщепление прочасти, в периплазме или в процессе транслокации через внешнюю мембрану, также остаются открытыми. Чтобы приблизиться к пониманию особенностей секреции литических эндопептидаз AlpA и AlpB L. species XL1, связанных с процессингом проча-сти, коллективом авторов было инициировано настоящее исследование, в основу которого легла разработка метода обнаружения прочастей (про-
пептидов) литических эндопептидаз AlpA и AlpB в различных компартментах клеток L. species XL1 с помощью моноклональных антител (МА).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Получение и характеристика моноклональных антител против пропептидов эндопептидаз AlpA и AlpB. Ранее было показано, что аминокислотные последовательности ProA (169 а.о.) и ProB (166 а.о.) при высокой степени гомологии (60.4%) имеют около тридцати различающихся участков размером не более 3 а.о. каждый [5]. Данные участки входят в состав эпитопов, предсказанных теоретически с помощью алгоритма для расчета антигенных детерминант [9], что позволило надеяться на получение высокоспецифичных МА.
Получение и характеристика МА ProB-1 описаны ранее [10]; в данной работе получено еще одиннадцать МА против ProB, вместе составивших достаточно представительную панель. Для получения МА в качестве антигенов использовали препараты рекомбинантных пропептидов ProA и ProB. Максимальный титр сыворотки иммунных мышей составлял 1 : 100000 при тестировании методом непрямого твердофазного иммунофермент-ного анализа (ИФА) на планшетах с иммобилизованными пропептидами (исходная концентрация 1 мкг/мл). Сыворотки демонстрировали высокую степень иммуноперекрестной реактивности с используемыми антигенами и соответствующими зрелыми формами белков, предположительно, из-за высокой степени их гомологии.
Для получения гибридом, секретирующих МА, выбирали спленоциты мышей, сыворотки которых максимально взаимодействовали с антигеном, используемым для иммунизации. При получении МА против ProA титр иммунной сыворотки при взаимодействии с ProA составлял 1 : 100000 и 1 : 50000 — при взаимодействии с ProB; при получении МА против ProB титр иммунной сыворотки при взаимодействии с ProB составлял 1 : 100000, а при взаимодействии с ProA — 1 : 50000.
Гибридные клетки получали путем слияния спленоцитов с клетками миеломной линии SP2/0 [11]. Было получено двенадцать стабильных ги-бридомных клонов, секретирующих МА против ProA, и двенадцать — против ProB.
Иммуноперекрестную реактивность полученных МА проверяли методом непрямого твердофазного ИФА по взаимодействию с иммобилизованными нативными антигенами. Только два антитела из двенадцати (ProA-1 и ProA-2) не обладали иммуноперекрестной реактивностью с ProB, а также со зрелыми формами эндопептидаз AlpA и AlpB. Остальные десять МА эффективно взаимодействовали как с ProA, так и с ProB, а также со зрелыми формами AlpA и AlpB. Таким обра-
зом, в качестве инструмента исследования секреции AlpA оказались пригодны только МА ProA-1 и ProA-2. Все двенадцать МА, полученных против ProB, не обладали иммуноперекрестной реактивностью с ProА, а также со зрелыми формами эндопептидаз AlpA и AlpB, поэтому все полученные антитела против ProB были использованы для дальнейшего исследования.
Проведена иммунохимическая характеристика всех МА: определены константы аффинности по методу Битти и соавт. [12], типы тяжелой и легкой цепей иммуноглобулинов. Показано, что все антитела имели в своем составе тяжелую цепь подкласса IgG1 и легкую к-цепь. Полученные МА обладали высоким сродством к антигену. Константы аффинности МА против ProB варьировали от 1.5 х 108 до 2.2 х 109 М-1, а для МА против ProA составили 3.5 х 109 и 2.9 х 109 М-1 (табл. 1).
Разработка метода количественного определения пропептидов эндопептидаз AlpA и AlpB в варианте сэндвич-ИФА. В основе этого метода лежит использование двух МА к двум разным эпитопам антигена, достаточно удаленным друг от друга. Удаленность эпитопов позволяет обоим МА одновременно взаимодействовать с молекулой белка антигена. Такой подход дает возможность детектировать искомый белок в исследуемом образце в недеградированном состоянии.
Подбор детектирующих пар МА проводили, как описано ранее [13], проверяя все возможны
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.