ГЕНЕТИКА, 2015, том 51, № 1, с. 39-45
= ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ =
УДК 579.25:616.9:593.12
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СИСТЕМАТИЧЕСКОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ ПОЧВЕННЫХ АМЕБ ИЗ ОЧАГОВ ЧУМЫ ПРИКАСПИЯ НА ОСНОВЕ АНАЛИЗА УЧАСТКОВ РИБОСОМНОГО ОПЕРОНА
© 2015 г. Е. И. Кошель, Л. В. Анисимова, Л. А. Новичкова, Н. А. Видяева, Н. П. Гусева, Г. А. Ерошенко, В. В. Кутырев
Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб", Саратов 410005
e-mail: rusrapi@microbe.ru Поступила в редакцию 30.04.2014 г.
Представлены результаты изучения систематической принадлежности и количественного содержания свободноживущих амеб в пробах почв из Прикаспийского Северо-Западного степного, Прикаспийского песчаного и Волго-Уральского степного очагов чумы в России. Из почв этих очагов выделены амебы родов Willaertia, Hartmanella, а также представители миксомицет, однако доминирующими по численности являются амебы рода Acanthamoeba, число которых в 1 г почвы может достигать 300000 клеток. На основе секвенирования участка гена 18S рРНК установлена принадлежность акантамеб из Волго-Уральского степного очага к виду A. castellanii. Проведенный филогенетический анализ подтвердил принадлежность амеб из двух других прикаспийский очагов к видам Acanthamoeba spp.
DOI: 10.7868/S0016675815010051
Амебы — одни из самых многочисленных членов различных типов природных биоценозов и встречаются практически повсеместно [1, 2]. В широком смысле, амебы представляют собой всю совокупность простейших, имеющих в своем жизненном цикле амебоидную форму, для которой характерно наличие псевдоподий (ложноножек). В эту группу входят не только представители типа Amoebozoa, включающего основную часть амебоидных простейших, в том числе истинных амеб рода Amoeba, но также члены и других таксонов. Они могут существовать в различных климатических зонах и долго сохраняться в неблагоприятных природных условиях благодаря своей способности образовывать цисты. Многие виды амеб живут в соленой и пресной воде, во влажной почве и на растениях; некоторые амебы являются паразитами животных, включая человека. Наиболее распространенными в почвенных и водных биоценозах являются такие рода амеб, как Acanthamoeba, Nagleria, Vahlkampfia, Hartmanella, Willaertia и др. [3—5].
Многие патогенные микроорганизмы имеют в своем жизненном цикле фазу внутриклеточного существования в амебах. В настоящее время показано, что свободноживущие амебы являются природными резервуарами опасных бактерий — Francisella tularensis, Legionella pneumophila, Vibrio cholerae, Chlamydophila pneumoniae, Mycobacterium leprae, Mycobacterium avium, Coxiella burnetii, Helicobacter pyloria; мими- и энтеровирусов [6—10]. Очевидно, что перечень микроорганизмов, кото-
рые могут персистировать в амебах, намного шире, и, на самом деле, масштаб механизма сохранения болезнетворных агентов в природе в ассоциации с амебами остается явно недооцененным. Способность микроорганизмов к персистенции в клетках амеб позволяет им не только в течение длительного времени поддерживать оптимальные условия своего существования, но и использовать ресурсы хозяйской клетки для увеличения своей численности, а в ряде случаев и для повышения инвазивности и вирулентности для человека [8, 9]. Считается, что амебы являются эволюционными предками макрофагов. Размножение в макрофагах является обязательной стадией развития многих опасных инфекционных болезней, включая чуму.
В последнее время высказывается предположение о возможности сохранения бактерий Yersinia pestis в почве природных очагов чумы в ассоциации с членами почвенных биоценозов, включая и свободноживущих амеб [11, 12]. Цикл активности большинства природных очагов чумы включает эпизоотическую фазу, во время которой наблюдаются интенсивные эпизоотии чумы на грызунах, и фазу покоя, когда зараженные грызуны не выявляются и культуры Y. pestis не выделяются. Межэпизоотическая фаза может длиться десятилетиями, и до сих пор остаются неясными механизмы сохранения возбудителя чумы в этот период. Одним из возможных природных резервуаров Y. pestis могут быть амебы из почвенных биоценозов очагов чумы. Однако в литературе имеется лишь одна работа, в
Систематическая принадлежность и численность амеб в почвах природных очагов чумы Прикаспия
Очаг Точка сбора материала Дата забора почвы Количество клеток амеб в 1 г почвы Род выделенных амеб
Волго-Уральский степной Норы малого суслика в окрестности пос. Александров Гай, Саратовская обл. 21.11.2012 г. 300000 Acanthamoeba (A. castellanii), Willaertia, Hartmanella
Прикаспийский Северо-Западный степной Норы малого суслика в окрестности пос. Тавн-Гашун, Калмыкия 16.04.2013 г. 200000 Acanthamoeba
Прикаспийский песчаный Норы полуденной песчанки в окрестности пос. Лагань, Калмыкия 29.04.2010 г. 27000 Acanthamoeba
которой экспериментально доказана способность выделенных из почвы цистообразующих амеб фагоцитировать клетки возбудителя чумы и включать их в свои предцисты [13]. В литературе также не представлены данные по видовому составу и численности амеб в почвах очагов чумы. Высокий показатель их численности является необходимым
42°
48°
54°
Рис. 1. Участки сбора образцов почв на территориях природных очагов Прикаспия. № 43 — Прикаспийский песчаный очаг, № 14 — Прикаспийский СевероЗападный степной очаг, № 15 — Волго-Уральский степной очаг. Номера очагов приведены в соответствии с работой [27]. Стрелками указаны места забора проб почв.
условием рассмотрения этих простеиших в качестве природных резервуаров возбудителя чумы.
Следует отметить, что использование только морфологических характеристик при установлении родовоИ и видовой принадлежности амеб может приводить к ошибкам в определении их систематического положения ввиду того, что форма и размер клеток варьируют в разных условиях [14, 15]. Гораздо более надежной альтернативой для определения систематической принадлежности простейших является выявление отличий в структуре их генома. Ввиду этого в международных информационных ресурсах увеличивается объем баз данных, содержащих нуклеотидные последовательности генов 18S, 5.8S, 28S рРНК и межгенных участков ITS1, ITS2 (internal transcribed spacers), входящих в состав рибосомного оперона амеб.
В этой работе нами приводятся данные по определению систематической принадлежности амеб из почв прикаспийских очагов чумы в России на основе анализа участков их рибосомных оперонов и данные по численности этих амеб. Также представлены результаты филогенетического анализа выделенных видов амеб.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Сбор образцов почвы и выделение амеб. Использованы образцы почв из Прикаспийского песчаного, В олго-Уральского степного и Прикаспийского Северо-Западного степного очагов чумы (таблица, рис. 1). Сбор проб проводили в различных участках одного сектора размером 10 х 10 км в каждом очаге. Для выделения амеб использовали плотную среду SM/10 (глюкоза — 1 г, Bacto-pepton — 1 г, дрожжевой экстракт — 1 г, MgSO4 • • 7Н2О - 0.2 г, КН2РО4 - 1.9 г, К2НРО4 - 1 г, Bacto-agar — 20 г, вода — до 1000 мл), на которой проводили совместное культивирование вытяжек почвы с суспензией штамма Escherichia coli 0Р50 при 28°С в течение 6 сут. Для получения аксенической (чистой) культуры амеб собранный с чашек материал в объеме 200—400 мкл обрабатывали 1 мл
раствора смеси антибиотиков — гентамицина, стрептомицина и ампициллина в концентрации 20 ед/мл каждого. После суточной экспозиции в растворе антибиотиков культуру промывали избытком фосфатного буфера (рН 6.4), центрифугировали при 4000 об/мин и ресуспендировали в 1 мл этого же буфера. Выделенные очищенные культуры амеб хранили в холодильнике при температуре 4°С.
Определение количественного содержания сво-бодноживущих амеб в пробах почв. Установление количества клеток свободноживущих амеб в образцах почв осуществляли по методике B.N. Singh с нашей модификацией [16]. Для пробы из каждого очага готовили 121 чашку Петри с 2-суточными газонами E. coli ОР50 на бедной агаровой среде (1.5% агар, NaCl - 5 г, CaCO3 - 1 г, вода - до 1000 мл). На выращенные газоны наносили в восьми повторах почвенные суспензии разной концентрации из 15 разведений от 1 : 5 до 1 : 81920 (шаг титра-ции 1 : 1) и инкубировали в течение месяца. Последующий учет полученных результатов осуществляли при помощи стереомикроскопа "Stemi-2000C" (Carl Zeiss, Германия). Количество амеб в 1 г исследуемого образца почвы определяли по таблице B.N. Singh на основе подсчета чашек, на которых амебы отсутствовали [16].
Определение систематической принадлежности амеб. Выделение ДНК амеб проводили из культур, полученных при совместном выращивании с бактериями E. coli ОР50. ДНК амеб получали стандартным методом при помощи набора для выделения ДНК из биологического материала "Diatom DNA Prep" (IsoGen Lab, Moscow) в соответствии с инструкцией производителя.
Родовую принадлежность амеб устанавливали по результатам ПЦР со специфическими прайме-рами на участки рибосомного оперона - ген 18S рРНК и спейсерные участки ITS [17, 18]. Последовательности праймеров JDP1/JDP2 для амплификации участка гена 18S рРНК: 5'GCCCA-GATCGTTTACCGTGAA/5'TCTCACAAGCTGC-TAGGGGAGTCA, температура отжига праймеров составляла 62°С. Праймеры ITS1/ITS2 для амплификации спейсерного участка рибосомно-го оперона имели состав 5'GAACCTGCGTAGG-GATCATTT/5'TTTCTTTTCCTCCCCTTATTA, а температура отжига равнялась 56°С.
Дифференциацию по родам проводили на основании анализа наличия и размеров полученных в ПЦР амплификатов. О присутствии в образце ДНК амеб рода Acanthamoeba судили по образованию в ПЦР с праймерами JDP1/JDP2 фрагмента размером 450 пн. В ПЦР с праймерами ITS1/ITS2 у амеб рода Nagleria образовывался фрагмент размером 450 пн, Willaertia — 500 пн, Vahlkampfia — 600 пн и Hartmanella — 800 пн.
Для видовой идентификации полученные в ПЦР фрагменты ДНК амеб секвенировали на генетическом анализаторе Applied Biosystems 3500xL. Анализ полученных последовательностей выполняли при помощи программы MEGA 5.0 [19]. Видовую идентификацию проводили с помощью алгоритма BLAST на основе базы нуклео-тидных последовательностей NCBI GenBank [20].
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.