ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2015, том 62, № 1, с. 146-152
МЕТОДЫ ^^^^^^^^^^^^^^ ИССЛЕДОВАНИЯ
УДК 581.1
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СКОРОСТИ ГЕНЕРАЦИИ АФК В МИТОХОНДРИЯХ РАСТЕНИЙ IN VITRO С ПОМОЩЬЮ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ ИНДИКАТОРОВ: НЕСПЕЦИФИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ ИНГИБИТОРОВ ТЕРМИНАЛЬНЫХ ОКСИДАЗ © 2015 г. Й. Р. Абдрахимова*,**, И. М. Андреев*, А. Г. Шугаев*
*Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, Москва **Федеральное государственное автономное образовательное учреждение Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань Поступила в редакцию 10.04.2014 г.
Исследовали возможность количественной оценки скорости генерации АФК митохондриями, выделенными из этиолированных проростков озимой пшеницы (Triticum aestivum L., сорт Мироновская 808), следя за аккумуляцией перекиси водорода в среде инкубации органелл с помощью новой высокочувствительной тест-системы, включающей флуорогенный индикатор Amplex Red и перок-сидазу корней хрена. Скорость процесса составляла около 100 пмоль Н2О^(мг белка мин) в состоянии 3, увеличивалась почти в 2 раза при переходе митохондрий в состояние 4 и дополнительно возрастала более чем на 50% после добавления к ним антибиотика-порообразователя аламетицина, вызывающего пермеабилизацию внутренней мембраны органелл для низкомолекулярных соединений, в том числе молекул H2O2. Приведены экспериментальные доказательства того, что классические ингибиторы терминальных оксидаз дыхательной цепи митохондрий растений, такие как цианид, салицилгидроксамовая кислота и пропилгаллат, способны инактивировать АФК-де-тектирующие тест-системы in vitro путем взаимодействия с их функциональными компонентами. Эти результаты обсуждаются в сравнении с имеющимися в литературе данными, полученными с использованием аналогичных тест-систем, и указывают на существенные ограничения применения последних, в частности при выявлении антиоксидантной роли альтернативной цианид-резистентной оксидазы в митохондриях растений.
Ключевые слова: Triticum aestivum — митохондрии — активные формы кислорода — флуоресцентные индикаторы — Amplex Red — аламетицин
DOI: 10.7868/S0015330314060025
ВВЕДЕНИЕ
Не снижающийся в течение последних десятилетий интерес к проблемам образования активных форм кислорода (АФК) и механизмам регуляции их метаболизма (генерации и удаления) обусловлен той важной ролью, которую они игра-
Сокращения: АО — альтернативная оксидаза (от Alternative Oxidase); ДМСО — диметилсульфоксид; СГК — салицилгидроксамовая кислота; AR — Amplex Red; DCF — дихлорофлу-оресцеин; H2DCFDA — 2,7-дихлородигидрофлуоресцеин-диацетат; FCCP -карбонилцианид-(п)-трифторметоксифе-нил-гидразон; HP — пероксидаза корней хрена (от Horseradish Peroxidase); Уафк — скорость аккумуляции генерируемых митохондриями АФК снаружи органелл; Aym — мембранный потенциал митохондрий.
Адрес для корреспонденции: Абдрахимова Йолдыз Раисовна. 127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН. Факс: +7 (499) 977-80-18; электронная почта: yoldez@mail.ru
ют на протяжении всей жизнедеятельности клеток от деления до смерти [1]. Одними из наиболее обсуждаемых вопросов в биологии и биомедицине остаются те, что связаны с двойственной функцией АФК, генерируемых клетками при различных видах стресса. С одной стороны, это связано с выяснением механизмов развития патологических состояний организмов в результате окислительного стресса, возникающего вследствие нарушений редокс-баланса клеток, т.е. избыточной генерации АФК и их повреждающего действия на все ключевые структуры клетки, включая мембраны, белки и ДНК. С другой стороны, это обусловлено возможностью участия АФК в трансдукции тех или иных сигналов, и в частности наличием в клетках сигнальных путей, запускаемых АФК, в том числе от митохондрий [1—3]. Очевидно, что такого рода исследования
требуют относительно быстрого и высокоспецифичного количественного определения скорости генерации АФК. Однако решение этой задачи существенно осложняется низкими внутриклеточными концентрациями АФК, транзиторным характером изменений и относительно коротким периодом их жизни, а также наличием в клетках и отдельных органеллах достаточно эффективных систем антиоксидантной защиты [1, 4]. В связи с этим, остается актуальной проблема поиска и оптимизации методов адекватной оценки скорости образования АФК и быстрых изменений их внутриклеточной концентрации.
Известно, что широко применяемые флуоресцентные красители класса дихлорофлуоресцеи-нов (DCF) не лишены недостатков, которые детально рассмотрены в ряде обзоров последних лет [5, 6]. В настоящее время одним из относительно новых и наиболее высокочувствительных флуо-рогенных индикаторов для определения АФК in vitro является Amplex Red (AR), окисление которого путем его взаимодействия с Н2О2 со стехиометрией 1 : 1 катализируется пероксидазой хрена (HP). Благодаря этому образуется спектрально различимый продукт этой реакции — ре-зоруфин, который может быть идентифицирован как по его флуоресценции, так и по абсорбции [7]. Следует отметить, что хотя данная тест-система широко используется для определения скорости образования АФК митохондриями животных [8—12], примеры ее применения в аналогичных исследованиях, выполненных на растительных органеллах, единичны [2].
Целью наших исследований было определение скорости образования перекиси водорода в митохондриях, изолированных из проростков пшеницы, находящихся в различных метаболических состояниях, используя AR в качестве индикатора. Другая важная задача работы состояла в выяснении возможности применения ингибиторов терминальных оксидаз ЭТЦ, в частности альтернативной цианид-резистентной оксидазы (АО), для изучения их влияния на генерацию АФК митохондриями растений с помощью данной тест-системы.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Растительным материалом служили этиолированные проростки озимой пшеницы (Triticum aestivum L., сорт Мироновская 808), выращенные гидропонным способом на водопроводной воде при 23—24°C в течение 3 суток. Семена сортовой элиты были любезно предоставлены акад. И.Б. Сандухадзе (МосНИИСХ РАН, Нем-чиновка, Московская обл.).
Выделение митохондрий и контроль их функциональной активности проводили по методике,
детально описанной нами ранее [13]. Для этого побеги (колеоптили вместе с зародышевыми листьями) гомогенизировали со средой выделения (соотношение 1 : 6), содержащей 0.3 М сахарозу, 18 мМ калий-фосфатный буфер (рН 7.9), 1 мМ MgCl2, 5 мМ ЭДТА, 5 мМ дитиотрейтол и 0.1% бычий сывороточный альбумин (БСА), свободный от ЖК. Выделенные путем дифференциального центрифугирования митохондрии ресус-пендировали в малом объеме среды, содержащей 0.3 М сахарозу, 18 мМ калий-фосфатный буфер (рН 7.2) и 0.1% БСА, и помещали на лед на все время проведения экспериментов.
Поглощение кислорода митохондриями измеряли в реакционной среде, содержащей 0.3 М сахарозу, 18 мМ калий-фосфатный буфер (рН 7.2), 1 мМ МgСl2, 5 мМ ЭДТА, 0.1% БСА, при 25°С с использованием электрода типа Кларка ("Hansatech Instruments", Англия). Скорости дыхания митохондрий при окислении 10 мМ малата в присутствии 10 мМ глутамата составляли в среднем 120— 130 и 35—40 нмоль О2/(мг белка мин) в состоянии 3 (после добавления 200 мкМ АДФ) и состоянии 4 (после его исчерпания в процессе фосфорилиро-вания), соответственно. Коэффициенты дыхательного контроля по Чансу и отношения АДФ/О [14] в среднем составляли 3.5 и 3.0, соответственно. Выделенные митохондрии были способны к быстрой и стабильной в течение длительного времени генерации трансмембранного потенциала на внутренней мембране (Aym), за которой следили, используя сафранин О [13].
Образование АФК митохондриями тестировали сразу после выделения органелл, используя AR ^-ацетил-3,7-дигидроксифеноксазин) в комбинации с пероксидазой хрена (HP). Измерения проводили в стандартной реакционной среде, содержащей 0.3 М сахарозу, 18 мМ калий-фосфатный буфер (рН 7.2), 1 мМ МgСl2, 5 мМ ЭДТА, 0.1% БСА, 5 мМ малат, 5 мМ глутамат и 0.15— 0.2 мг/мл белка митохондрий. Соотношение компонентов тест-системы для опытов подбирали эмпирически, в большинстве проб оно составляло 10 мкМ AR и 1—10 ед./мл HP. Образование ре-зоруфина — продукта реакции взаимодействия AR с Н2О2 — регистрировали спектрофотометри-чески, следя за изменением дифференциальной абсорбции (АЛ573-595) на спектрофотометре Hita-chi-557 [10]. Интенсивность флуоресценции рез-оруфина измеряли на спектрофлуориметре Hita-chi-850 (длина волны возбуждения — 564 нм, регистрации — 587 нм) [2]. В случае использования другого индикатора, 2,7-дихлородигидрофлуо-ресцеин-диацетата (H2DCFDA), флуоресценцию его деацетилированного и окисленного продукта DCF возбуждали светом с длиной волны 480 нм и регистрировали при 552 нм [7, 15, 16]. Чувствительность выбранных тест-систем проверяли до-
Рис. 1. Зависимость величины абсорбционного сигнала резоруфина от концентрации Н2О2 в реакционной среде, не содержащей митохондрий, и влияние на сигнал 1 мМ КС^
Остальные условия указаны в разделе "МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ".
бавлением к ним 50—100 нМ свежеприготовленного раствора H2O2 в конце каждой пробы.
Содержание митохондриального белка в пробах определяли по методу Lowry с соавт. [17], используя БСА в качестве стандарта.
Реактивы. В работе использовали KCN, КН2РО4 и другие соли отечественного производства марки о. с. ч. или х. ч.; сахарозу, субстраты, нуклеотиды, пероксидазу, ЭДТА, БСА, аламети-цин, H2DCFDA - фирмы "Sigma" (США); Am-plex Red — фирмы "Invitrogen" (США).
Статистика. Каждый опыт проводили в 3— 4 биологических и 2—3 аналитических повторно-стях. На рисунках представлены результаты характерных опытов.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Как известно, потенциальные возможности любой тест-системы определяются степенью ее чувствительности и специфичности. Исходя из этого, прежде всего необходимо было протестировать влияние Н2О2 и других использованных в работе реагентов на поведение самой тест-систе-
мы на основе AR, а именно флуоресценцию/абсорбцию резоруфина в реакционной смеси, в том числе при отсутствии в ней митохондрий с целью исключения нежелательн
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.