БИОФИЗИКА, 2015, том 60, вып. 4, с. 722-728
== БИОФИЗИКА КЛЕТКИ= =
УДК 576.8/57.08/579/579
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СПЕКТРА ЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ БАКТЕРИОФАГОВ МЕТОДОМ АКУСТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА
© 2015 г. О.И. Гулий* ** ***, Б.Д. Зайцев****, И.Е. Кузнецова*****, А.М. Шихабудинов****, Л.А. Дыкман* ***, С.А. Староверов* ** ***, О.А. Караваева*, С.А. Павлий******, О.В. Игнатов*
*Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, 410049, Саратов, пр. Энтузиастов, 13;
**Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова, 410012, Саратов, Театральная пл., 1;
***Саратовский научно-исследовательский ветеринарный институт РАН, 410028, Саратов, ул. 53 Стрелковой Дивизии, 6;
**** Саратовский филиал Институтарадиотехники и электроники им. В.А Котельникова РАН,
Саратов, 410019 Саратов, ул. Зеленая, 38;
*****Институт радиотех ники и элект роники им. В.А. Котельникова РАН, 125009, Москва, ул. Мох овая, 11/7;
******Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского, 410012, Саратов, ул. А страханская, 83 E-mail: guliy_olga@mail.ru Поступила в p едакцию 09.02.15 г.
Изучены изменения электpоакуcтичеcкиx паpаметpов cуcпензии клеток пpи взаимодействии c бактеpиофагами, как в чистой культуpе, так и в cмешанной cуcпензии клеток. Установлено, что cпецифичеcкие изменения паpаметpов клеточный cуcпензий под действием фага пpоиcxодят только у микробных клеток, чувствительные к изучаемому бактеpиофагу. Установлено, что датчик позволяет pазгpаничивать ситуации, когда пpоиcxодит инфициpование бактеpиальныx клеток cпецифичеcкими бактеpиофагами от консольный экcпеpиментов, когда такого инфи-циpования не пpоиcxодило. Выработан оpиентиpовочный кpитеpий наличия cпецифичеcкого взаимодейcтвия бактеpиофагов и клеток в анализиpуемой cуcпензии, который заключаетcя в том, что изменение модуля электpичеcкого импеданcа датчика не должно быть менее ~1%. П pоведены контpольные экcпеpименты по инфицированию клеток бактеpиофагом c помощью cтандаpтного микpобиологичеcкого выcева на плотные питательные cp еды. Впеpвые показана возможность использования метода электpоакуcтичеcкого анализа для опpеделения cпектpа литичеcкой активноcти бактеpиофагов. Полученные pезультаты могут быть использованы для cоздания экcпpеcc-метода опpеделения чувствительности микробных клеток к бактеpиофагам.
Ключевые слова: спектр литической активности, бактериофаги, микробные клетки, электроакустический метод анализа.
Бактер иофаги могут выступать в pоли биологического pецептоpа для детекции микроб-нык клеток [1] и пpедcтавляют интеpеc при изучении взаимодействия бактериофаг-микробная клетка. Кроме того, бактериофаги могут быть использованы для диагностики многих возбудителей различных инфекционных заболеваний человека, животных и растений [2] и являются эффективным средством бор ьбы с этими возбудителями (в том числе с теми, которые устойчивы к действию антибиотиков) [3-6]. Эффективность обусловлена специфическим действием бактериофагов, а также простотой подготовки препаратов и их низкой стоимостью, по сравнению с разработкой новых антибио-
тиков против устойчивых штаммов бактерий. Стоит отметить, что в 1920-е гг. с помощью препаратов бактериофагов удалось излечить тысячи людей от дизентерии, тифа, холеры и других инфекционных заболеваний. Однако уже в 1940-е гг. после откр ытия антибиотиков применение бактериофагов в качестве лечебных профилактических препаратов против инфекционных заболеваний прекратилось.
В настоящее вр емя интер ес к бактериофагам появился вновь в связи с увеличением числа устойчивых к антибиотикам микроорганизмов. Тем не менее основным условием успешного применения бактериофагов является чувствительность возбудителя к соответствующему бак-
териофагу - фаговая специфичность. В настоящее время существует несколько способов определения чувствительности бактерий к бактериофагам, среди них:
- стандартные микробиологические методы [7,8];
- метод электроориентационной спектро-скопии, основанный на регистрации изменения оптических свойств микробной суспензии под влиянием переменного электрического поля;
- флуоресцентная спектроскопия, основанная на внесении в систему мембранотропного зонда и регистрации интенсивности флуоресценции [9];
- методы с использованием биосенсоров на основе бактериофагов [10,11].
В последнее вр емя активно развиваются исследования, направленные на изучение электрофизических свойств клеток. Это обусловлено рядом достоинств электрофизических методов анализа. Во-первых, существует тесная связь электрофизических хар актеристик клеток с про -цессами жизнедеятельно сти; во-вторых, измер е-ние этих характеристик можно проводить быстро и без разрушения клеток и клеточных структур, что позволяет исследовать процессы, протекающие в клетках in situ [12,13]. Акустические методы анализа привлекают все большее внимание исследователей для анализа биологических взаимодействий, поскольку характеризуются высокой чувствительностью и минимальным временем для проведения анализа. П ри этом значительный интерес вызывают пье-зоэлектр ические резонато ры с попер ечным электрическим полем, которые в отличие от традиционных резонаторов с продольным полем более чувствительны к контактирующей жидкости, поскольку реагируют как на изменение ее вязкости, так и проводимости. Существует большое количество статей и патентов, посвященных этим резонато рам и их использованию для решения биотехнологических задач [14-17].
Поскольку процедура определения спектра литической активности бактериофагов достаточно длительна, разработка метода экспрессного анализа чувствительности микробных клеток к бактериофагам является чрезвычайно важной. В связи с этим целью работы является развитие метода электроакустического анализа клеточных суспензий для определения спектра литической активности бактериофага и решения вопроса о чувствительности микробных клеток к бактериофагам.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Микроорганизмы. В работе использовали микроорганизмы Escherichia coli штаммов XL-1, К-12, B-878, BL-Ril, pHENl, pUC18, pBR325, Azospirillum brasilense Sp7 (IBpPM 150), полученные из коллекции pизоcфеpныx микpооp га-низмов ИБФРМ РАН. В pаботе также использовали штаммы микpооpганизмов, полученные из коллекции лабоpатоpии Cаpатовcкого НИИ «Биокатализа»: Pseudomonas putida БА-11 (ВКПМ В-6707), Pseudomonas putida С-11 (ВКПМ В-6708) и Acinetobacter calcoaceticum A-122.
Ми^ ооpганизмы xp анили пpи 4°С на чашках Петpи с твеpдой питательной cpедой LB, cодеp жащей 3% агаp-агаp а (для клеток кишечной палочки). Ми^обные клетки пеpеcевали каждые две недели.
Культивирование микроорганизмов. Для культивиpования бактеpий иотользовали жидкую питательную cpеду LB [18] оледующего отстава (г/л): Nad (Becton, Dickinson & Со., США) - 10,0; пептон (Becton, Dickinson & Со., США) - 5,0; дpожжевой экстракт ^№СО, С ША) - 5,0. Полужидкая cp еда LB cодеpжала 0,7% агаp-агаp а; твеp дая - 1,5 и 3% агаp-агаpа.
Культуp ы бактеpий вьфащивали в 250-мил-лиметpовыx колбах Эpленмейеpа на жидкой cp еде LB. Инкубиpование клеток пpоводили на кpуговой качалке пpи интенcивноcти пеpеме-шивания 160 об/мин пpи 30 ± 1°С в течение 18-20 ч.
Инфицирование клеток бактериофагом. Ин-
фициpование ми^обных клеток E. coli XL-1 пpоводили c ^пользованием нитчатого фага М13К07 cемейcтва Inoviridae. М13 К07 коммеp-чеcкий пpепаpат фиpмы Stratagene (Швеция), имеющий уcтойчивоcть к канамицину, был cконcтpуиpован на оcнове дикиго типа фага М13 [18;19]. Для инфициpования бактеp иофагом бактеpиальную культуpу E. coli XL-1 выcевали из отдельной колонии c чашки c агаpизованной cpедой LB, cодеpжащей 12,5 мкг/мл тетpацик-лина в 2 мл cp еды LB, инкубиpовали в течение ночи пpи постоянной аэpации и 37°С, затем 1/10 часть ночной культуpы rop еcевали в cве-жую cp еду того же от става и p аcтили до эте-поненциальной фазы pоcта, пpи 37°С и аэpации [18,19]. По достижении pанней логаpифмиче-cкой фазы pоcта (ОД600 = 0,5 - 0,6, что отот-ветствует 7-108 клеток/мл) аэp ацию пpекpащали на 30-40 мин для воccтановления F-пилей и инкубиpовали cуcпензию в теp моcтате пpи 37°С. Концентp ацию микp ооpганизмов подcчитывали cтандаpтным методом c иcпользованием cвето-вой ми^о cкопии. Для инфициpования ми^об-
ных клеток вносили бактериофаг из расчета 20 фаговых частиц на одну клетку. После прибавления фагов культуру инкубировали при 37°C в термостате без покачивания для сор бции фаговых частиц на поверхности пилей.
Выделение и характеристика бактериофагов. Выделение бактериофагов проводили поср едст-вом воздействия низкой температур ы [18]. Выращенную культуру микроорганизмов охлаждали в холодильнике при 4°C в течение 1,5-2 ч для стимуляции выхода бактер иофагов из клеток. После этого пр оводили центрифугир ование при 2500 g в течение 40 мин. К надосадочной жидкости добавляли 1/5 объема 20% раствора полиэтиленгликоля (PEG 6000, Раигеас, И спа-ния) с добавлением 1,6 М NaCl (PEG/NaCl). Затем колбу с супер натантом обкладывали льдом и помещали в холодильник при 4°C на 2 ч. По истечении указанного вр емени проводили центрифугирование при 12000 g в течение 30 мин, супернатант сливали, пробирку переворачивали, ставили на фильтровальную бумагу и подсушивали около 30 мин. После этого к осадку добавляли 1 мл ТЕ-буфера (10 мМ трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, рН 7,5-8,0), ресуспен-дировали и центрифугировали при 10000 g в течение 5 мин. Cупеpнатант переносили в стерильную посуду и добавляли 1/5 объема PEG/NaCl, образовавшийся о садок быстр о размешивали и центрифугировали при 6500 g в течение 5 мин. Полученный осадок раствор яли в 1 мл ТЕ-буфера. Пробирки с суспензией бактериофага хранили в морозильной камере при температур е -20°C.
Определение концентрации фаговык частиц.
Количество фаговых частиц определяли спек-трофотометрически на пр иборе Бресогё BS-250 (Analytik Jena, Гер мания) в кювете объемом 1 мл. И сходя из того, что величина 30 опт. ед. соответствует значению 2-1014 фаговых частиц/мл [19], можно было для расчетов использовать следующую формулу: (А 269 - А 320)-5-1014/15, где А 269 - оптическая плотность суспензии при длине волны электромагнитного изл
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.