ЖУРНАЛ АНАЛИТИЧЕСКОЙ ХИМИИ, 2015, том 70, № 1, с. 30-36
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ =
УДК 543.42
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СРЕДНЕЙ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССЫ ГИДРОКСИЭТИЛКРАХМАЛОВ МЕТОДОМ ДИФФУЗИОННО-УПОРЯДОЧЕННОЙ СПЕКТРОСКОПИИ ЯМР © 2015 г. Н. Е. Кузьмина, С. В. Моисеев1, В. И. Крылов, В. А. Яшкир, В. А. Меркулов
Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научный центр экспертизы средств медицинского
применения"Минздрава России 127051 Москва, Петровский бульвар, 8 1Е-таИ: MoiseevSV@expmed.ru Поступила в редакцию 09.10.2013 г., после доработки 17.02.2014 г.
С использованием метода диффузионно-упорядоченной спектроскопии ЯМР получено корреляционное уравнение для оценки средней молекулярной массы (ММ) гидроксиэтилкрахмалов по измеренному коэффициенту самодиффузии Б. Проведено сравнение корреляционных уравнений ММ = сБ-а для гидроксиэтилкрахмалов, декстранов и пуллуланов. Показано, что постоянным значениям Б незаряженных полисахаридов с одинаковым типом невалентных взаимодействий и различной степенью ветвления соответствуют различные ММ.
Ключевые слова: диффузионно-упорядоченная спектроскопия ЯМР, средняя молекулярная масса полимеров, коэффициент самодиффузии, гидроксиэтилкрахмалы.
Б01: 10.7868/80044450215010107
Гидроксиэтилкрахмалы (ГЭК) являются эффективными коллоидными плазмозаменителя-ми, которые на протяжении последних 50 лет широко используют в клинической практике для профилактики и лечения гиповолемии в хирургии, травматологии, комбустиологии и интенсивной терапии [1—3]. Молекулярная структура ГЭК представляет собой полидисперсный разветвлен-
ный полимер амилопектин, состоящий из остатков а-Э-глюкопиранозы, модифицированной гидроксиэтильными группами (схема). Линейная часть макромолекул ГЭК содержит а(1 ^ 4) связи, разветвления образуются главным образом с помощью а(1 ^ 2) связей [4, 5]. Боковые ветви макромолекулы содержат от 15 до 45 остатков глюкозы.
ОН
Фрагмент молекулярной структуры ГЭК.
Важными характеристиками ГЭК, влияющими средняя молекулярная масса, молярное замещение на их фармакокинетические свойства, являются (МЗ) — отношение числа гидроксиэтильных
групп к общему числу молекул глюкозы и соотношение С2/С6, характеризующее отношение числа гидроксиэтильных групп, расположенных у второго атома углерода, к числу гидроксиэтильных групп, расположенных у шестого атома углерода в глюкопиранозном цикле [6—8]. ММ определяет время нахождения ГЭК в кровотоке. Макромолекулы ГЭК и фрагменты их ферментативного гидролиза, проникающие через почечный барьер (45—60 кДа), быстро элиминируются из организма [7]. Гид-роксиэтилирование замедляет ферментный гидролиз молекул ГЭК, продлевая тем самым время циркуляции препарата в кровотоке [8]. Аналогичный эффект оказывает высокое отношение С2/С6: чем выше отношение С2/С6, тем медленнее распад ГЭК [6-8].
Определение количественных характеристик ГЭК (ММ, МЗ и С2/С6) - достаточно сложная и трудоемкая задача, которую в фармакопейном анализе решают с использованием комплекса хроматографических методов: гель-проникающей хроматографии (ГПХ) (определение ММ), ГХ и ВЭЖХ (определение МЗ и С2/С6) [9, 10]. Применение хроматографических методов для определения МЗ и С2/С6 основано на деструкции анализируемого ГЭК. В связи с этим актуальна разработка недеструктивного экспресс-метода, позволяющего быстро и надежно оценить все количественные характеристики ГЭК с использованием одной пробы образца при минимальной пробоподготовке. Для разработки такого метода используют, главным образом, ЯМР-спектроско-пию. Количественное определение МЗ и мест замещения ГЭК осуществляют на основе данных спектров 1Н и 13С ЯМР [4, 11-16]. Методы традиционной ЯМР спектроскопии не применимы для определения ММ полимеров. Наиболее перспективен в этом направлении метод диффузионно-упорядоченной спектроскопии ЯМР (Diffusion Ordered Spectroscopy, DOSY), позволяющий измерить диффузию различных молекулярных объектов (молекул, макромолекул, молекулярных комплексов, супрамолекулярных систем) под действием градиента магнитного поля [17-19]. Метод DOSY обладает большим потенциалом в исследовании молекулярных масс полимеров [20-23], в том числе полисахаридов [24-28]. На практике [26-28] ММ полисахаридов в рамках метода DOSY оценивают по предложенному авторами [24] корреляционному уравнению зависимости ММ полисахаридов от коэффициента самодиффузии D, который численно равен среднеквадратичному смещению молекулы за время диффузии td [29]. Данное уравнение получено на основе анализа линейных и малоразветвленных полисахаридов (декстранов и пуллуланов). Известно, что топология полимера существенно влияет на диффузию, поскольку разветвленные молекулы всегда имеют меньшие, чем у линейных аналогов, гидродинамические радиусы
[30], поэтому использование представленного в литературе [24] корреляционного уравнения для количественной оценки ММ ГЭК может привести к некорректным результатам.
Цель данной работы — исследование влияния ветвления на величину D полисахаридов и установление корреляционной зависимости между ММ и D ГЭК, учитывающей особенности их пространственного строения.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В качестве объектов исследования использовали стандартные образцы ГЭК производства компании American polymer standards corporation (США) со средними молекулярными массами
Мр1 5.5, 8.9, 16.1, 52.8, 80.0, 121.1, 153.6, 176.1, 201.0, 219.3, 330.2, 374.0, 396.9, 468.7, 1004.0 кДа (HETA 6K, HETA 9K, HETA 18K, HETA 60K, HETA 88K, HETA 130K, HETA 160K, HETA 175K, HETA 230K, HETA 250K, HETA 337K, HETA 380K, HETA 460K, HETA 600K, HETA 1300K соответственно). Спектры 1Н и ^-DOSY регистрировали на ЯМР-спектрометре Agilent DD2 NMR System 600 с 5-мм инверсным мультиядерным датчиком, оснащенным градиентной катушкой, при 300 К. Анализируемые образцы (5 мг) растворяли в 0.5 мл D2O (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.). Полученные растворы разбавляли D2O до концентрации 1 мг/мл и переносили в ЯМР-ам-пулы Shigemi со стеклянным плунжером для минимизации эффектов конвекции и неоднородности импульсов градиента магнитного поля. Для измерения коэффициентов самодиффузии использовали последовательность DBPPSTE (DOSY Bipolar Pulse Pair Stimulated Echo). Кривые диффузионного затухания получали при последовательном 15-шаговом линейном увеличении амплитуды импульса градиента магнитного поля в интервале от 1.82 до 53 Гс/см при фиксированных значениях времени диффузии А (285 мс), длительности градиентного импульса 8имп (2.0 мс) и времени релаксации d1 (5 с). Результаты математически обрабатывали методом DISCRETE (Discrete Sum of Exponential Decays). При выводе корреляционного уравнения использовали программное обеспечение MS Excel 2007.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
ГЭК представляет собой полидисперсный полимер, ММ которого является среднестатистической величиной и зависит от способа усреднения. В химии полимеров различают среднечисловую
1 Мр — молекулярная масса пика в максимуме при определении средней молекулярной массы полимера методом экс-клюзионной гель-проникающей хроматографии.
Таблица 1. Коэффициенты самодиффузии компонентов водных растворов ГЭК, определенные методом (с = 1 мг/мл, 300 К, 5имп = 2 мс, А = 285 мс)
ГЭК Мр гаю кДа Б, 10— 10 м2/с ГЭК мр гаю кДа Б, 10— 10 м2/с
ГЭК вода ГЭК вода
НЕТА 6К 5.5 1.169 20.2 ± 0.1 НЕТА 230К 201.0 0.305 20.1 ± 0.1
НЕТА 9К 8.9 0.986 20.2 ± 0.1 НЕТА 250К 219.3 0.302 20.2 ± 0.1
НЕТА 18К 16.1 0.731 20.2 ± 0.1 НЕТА 380К 330.2 0.241 20.2 ± 0.1
НЕТА 60К 52.8 0.548 20.1 ± 0.1 НЕТА 460К 396.9 0.239 20.2 ± 0.1
НЕТА 88К 80.0 0.415 20.1 ± 0.1 НЕТА 600К 468.7 0.197 20.1 ± 0.1
НЕТА 160К 153.6 0.356 20.2 ± 0.1 НЕТА 1300К 1004 0.142 20.2 ± 0.1
(Мп) и средневесовую (М№) молекулярные массы. Мп получают усреднением по числу макромолекул в полимере, — усреднением по массе макромолекул в полимере. Величина М„ чувствительна к высокомолекулярным фракциям, а Мп — к низкомолекулярным фракциям полидисперсных полимеров, поэтому для характеристики средней ММ ГЭК мы использовали усредненный параметр — молекулярную массу в пике (Мр), которую определяют хроматографическими методами. Для узкодисперсных образцов Мр = (Мж х Мп)05 [31]. Корреляционная зависимость между величинами ММ и Б описывается степенной функцией [24, 27, 32, 33]:
Б = сММа,
где с и а — числовые константы, зависящие от условий эксперимента, параметров импульсной градиентной последовательности, размера исследуемого объекта, типа невалентных взаимодействий с его участием.
Зависимость величины Б от размера молекулярных объектов и условий проведения эксперимента (температура, вязкость раствора) описывает уравнение Стокса—Эйнштейна [21]:
Б = кТ/6пцЯъ,
где к — постоянная Больцмана, Дж К-1; Т — абсолютная температура, К; п — вязкость раствора, Н с м-2; К^ — гидродинамический радиус, м.
Значение ^ складывается из собственно радиуса диффундирующей частицы и толщины сольватной оболочки. При исследовании самодиффузии частиц, форма которых отличается от сферической, Вь обычно трактуют как средний гидродинамический радиус твердой сферы, которая при прочих равных условиях имела бы ту же величину Б в заданном растворе, что и исследуемый объект.
Влияние выбранной импульсной градиентной последовательности на величину Б описывает аналитическая функция Стейскала—Таннера, которая аппроксимирует зависимость амплитуды
сигнала спинового эха от параметров импульса градиента магнитного поля [34]:
/(8, А) = /оехр[—Бу2^252имп(А—8имп/3)],
где / и /0 — амплитуда сигнала спинового эха в присутствии и в отсутствие импульса градиента магнитного поля; А — время диффузии, мс; 8имп — длительность градиентного импульса, мс; у — гиромагнитное отношение для данного ядра, Гц Тл—1; g — градиент магнитного поля, Тл м—1.
Для незаряженных полисахаридов предложено следующее корреляционное уравнение [24]:
Б = 8.2 х 10—9М°'49 М Да; Б, м2/с).
(1)
Обращает на себя внимание тот факт, что уравнение (1) выводили при варьируемых для каждого анализируемого образца параметрах импульсной градиентной последовательности: А = 400—1000 мс, 8имп = 1.0—2.3 мс, т.е. имела место "подгонка" значений Б под определенную мате
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.