ЖУРНАЛ АНАЛИТИЧЕСКОЙ ХИМИИ, 2007, том 62, № 1, с. 76-84
^=ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ =
УДК 543.544
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТЕРОИДОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ МЕТОДОМ МИЦЕЛЛЯРНОЙ ЭЛЕКТРОКИНЕТИЧЕСКОЙ
ХРОМАТОГРАФИИ
© 2007 г. Л. А. Карпова, Е. А. Бессонова
Санкт-Петербургский государственный университет, химический факультет 198904 Санкт-Петербург, Петродворец, Университетский просп., 2 Поступила в редакцию 06.08.2005 г., после доработки 12.12.2005 г.
Методом мицеллярной электрокинетической хроматографии показана возможность определения восьми стероидных гормонов коры надпочечников (кортизола, кортизона, кортикостерона, 11-дегид-рокортикостерона, 11-дезокикортикостерона, 17-оксипрогестерона, 11-дезоксикортизола и прогестерона) с использованием мочевины в качестве органической добавки в составе рабочего электролита (25 мМ раствор фосфорной кислоты, 10 мМ додецилсульфат натрия). Применение on-line концентрирования (стэкинга и свипинга) позволило снизить предел обнаружения стероидов до ~3 нг/мл. Общее время анализа составило 15 мин.
В последние годы стали появляться сообщения об использовании метода капиллярного электрофореза (КЭ) [1-13] и капиллярной электрохроматографии (КЭХ) [14] для определения кортико-стероидов в различных биологических объектах. Метод мицеллярной электрокинетической хроматографии (МЭКХ), позволяющий разделять как ионогенные, так и нейтральные компоненты проб, предложен Терабе в 1984 г. [15]. Разделение нейтральных компонентов анализируемых проб стало возможным благодаря введению в состав буферного электролита поверхностно-активных веществ (ПАВ) - мицеллообразователей. Чаще всего для этой цели используют анионные ПАВ (например, додецилсульфат натрия - ДДСН) в концентрациях, превышающих критическую концентрацию мицеллообразования (ККМ).
Имеются немногочисленные публикации по анализу стероидных гормонов методом МЭКХ, однако, эти сообщения носят разрозненный характер и касаются в основном разделения смесей заведомых стандартных соединений. Использование МЭКХ для определения кортикостероидов в биологических объектах ограничено из-за низкой концентрационной чувствительности метода КЭ с УФ-детектированием. Решение этой проблемы возможно при использовании различных вариантов on-line концентрирования (стэкинга или свипинга) [16-21].
Стэкинг представляет собой метод концентрирования, при котором ионы образца достигают границы, отделяющей зону высокой проводимости раствора буферного электролита и зону низкой электропроводности, занятой анализируе-
мым раствором. Пробу перед вводом разбавляют рабочим буферным раствором или водой, и внутри этой зоны (с низкой проводимостью) определяемые вещества движутся с высокой локальной скоростью, концентрируясь на границе, разделяющей эти две зоны.
Свипинг - это вариант концентрирования ионогенных и нейтральных компонентов анализируемых проб в режиме МЭКХ, основанный на взаимодействии псевдостационарной мицеллярной фазы с разделяемыми соединениями. В отличие от стэкинга при свипинге растворы рабочего электролита и пробы имеют одинаковую электропроводность, при этом мицеллы в зоне образца отсутствуют. Сочетанием стэкинга и свипинга можно достичь 10000-кратного увеличения чувствительности метода [20].
Для определения стероидных гормонов в режиме МЭКХ используют различные ПАВ: анионные (например, ДДСН - додецилсульфат натрия) [1, 2, 9, 10], биологически-активные (холат, дезоксихо-лат, таурохолат натрия) [3, 5, 7]; катионные (доде-цилтриметиламмоний бромид - ДТАБ) [9, 12]; смешанные мицеллярные системы [4] и микроэмульсионные псевдостационарные фазы [7]. Наиболее эффективно концентрирование при стэкинге и свипинге в условиях подавления электроосмотического потока, которые реализуются в кислой среде (при рН < 5.5) с использованием анионного ДДСН.
В данной работе изучены возможности мицеллярной электрокинетической капиллярной хроматографии с УФ-детектированием для определения кортикостероидов в биологических жидкостях с
использованием различных вариантов on-line концентрирования.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Аппаратура. Определение кортикостероидов проводили на приборе "Капель 103-РЕ" с фотометрическим детектором (254 нм). Использовали немо-дифицированный кварцевый капилляр с внутренним диаметром 75 мкм при внешнем диаметре 365 мкм. Общая длина капилляра 80 см, эффективная длина 30 см. Перед анализом капилляр последовательно промывали дистиллированной водой (5 мин), 0.5 М раствором NaOH (10 мин), снова дистиллированной водой (5 мин), затем соответствующим буферным электролитом (15 мин). Между анализами капилляр промывали в течение 2 мин рабочим буферным раствором.
Ввод пробы - гидродинамический; параметры ввода в каждом случае оптимизировали, варьируя произведение давления ввода на время ввода (мбар х с). Рабочее напряжение изменяли в диапазоне от +15 до +25 кВ; при этом сила тока не превышала 120 мкА.
Реактивы и материалы. Для подготовки буферных электролитов и экстракции использовали: ацетонитрил (сорт "0" "Криохром"), этанол (ч.д.а., "Вектон", Россия); хлороформ (ч.д.а., "Реахим"); дихлорметан (х.ч., "Синтакон"); метанол (х.ч., Merck, Германия); мочевину (х.ч.), соляную кислоту ("Вектон", Россия), уксусную кислоту, орто-фосфорную кислоту (х.ч. "Реахим"); гидроксид натрия (х.ч. "Экрос", Россия); фосфатный буферный раствор (стандарт-титр, J, Na2HPO4, kH2P04, pH 6.84, х.ч., "Экрос"); додецилсульфат натрия (х.ч., Supelco, США); холат натрия ("Acros organ-ics"); дистиллированную воду. В качестве макро-циклического агента использован немодифици-рованный в-циклодекстрин (Supelco, США). Объектами исследования служили стероидные гормоны: кортизол (F), кортизон (E), кортико-стерон (B), 11-дегидрокортикостерон (A), тестостерон (T), 11-дезоксикортикостерон (DOC), 11-дезоксикортизол (S), прогестерон (Pr), 17-окси-прогестерон (17-OHPr) (х.ч. "Sigma", США).
Боратный буферный раствор (0.1 М) готовили по точной навеске кристаллогидрата тетрабората натрия (190.5 мг на 5 мл раствора), доводили рН до 9.2 раствором NaOH (0.5 М) или раствором H3BO3 (1 М).
Концентрированные растворы додецилсуль-фата натрия и холата натрия (0.5 М) готовили растворением точной навески вещества (144.2 и 215.25 мг на 1 мл раствора, соответственно) в дистиллированной воде.
Стандартные растворы кортизола, кортизона, кортикостерона, тестостерона, 11-дезоксикорти-костерона, 11-дезоксикортизола, прогестерона, дегидроэпиандростендиона (1 мг/мл) готовили растворением точных навесок каждого из стероидов (1 мг) в 1 мл этанола во фторопластовых закрывающихся пробирках. Рабочие растворы получали разбавлением стандартных растворов. Для разбавления пробы использовали дистиллированную воду, рабочий электролит в меньшей концентрации (5 мМ), раствор ортофосфорной кислоты с электропроводностью, равной по величине электропроводности рабочего электролита: (а) без добавления ПАВ, (б) без добавления ПАВ, но с добавкой 5 мМ в-циклодекстрина. Растворы хранили в морозильной камере при температуре -20°С.
Подготовка реального образца к анализу. В
качестве реальных объектов анализа использовали сыворотку крови и мочу больных с различными эндокринными нарушениями (отбор производился в 9 ч утра, так как секреция кортикостероидов подвержена циркадной ритмике; анализировали мочу, собранную за сутки). До анализа образцы хранили в холодильнике в замороженном виде (-20°С).
Жидкостную экстракцию сыворотки (мочи) осуществляли по следующей схеме: экстрагировали кортикостероиды из 1 мл сыворотки или 2 мл мочи пятикратным объемом метиленхлори-да (хлороформа), 0.5 мл (для мочи - 1 мл) органического экстракта затем промывали 0.1 М раствором №ОН для отделения более полярных, чем кортикостероиды, веществ (фенольных эстрогенов, нестероидных липидов и др.). Процедуру промывания щелочью выполняли быстро и предпочтительно на холоду, чтобы избежать потери извлекаемых кортикостероидов. Далее экстракт промывали 1 мл (для мочи - 2 мл) дистиллированной воды, сушили в течение получаса над безводным сульфатом натрия и выпаривали в токе воздуха. Сухой остаток растворяли в 30 мкл раствора рабочего электролита для последующего элек-трофоретического анализа.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Стероидные гормоны находятся в растворе в виде нейтральных молекул, что обусловливает возможность их определения методом мицеллярной электрокинетической хроматографии (МЭКХ) [115]. Введение в состав электролита мицеллообра-зователя при концентрации выше ККМ способствует образованию псевдостационарной фазы, в результате чего реализуется иной принцип разделения компонентов по сравнению с капиллярным зонным электрофорезом (КЗЭ). Разделение нейтральных компонентов анализируемой пробы
Таблица 1. Условия и некоторые характеристики разделения стероидов методом при различных значениях рН
Контролируемый параметр Фосфорная кислота (рН 2.5) с добавкой мочевины Боратный буфер рН 9.2 Фосфорная кислота (рН 2.5) с метанолом
Полярность Отрицательная Нормальная Отрицательная
Скорость ЭОП (см2/В с) —- 0 3.6 х 10-4 —► 0
Эффективность, т.т./м Рг - 350000 Рг - 45000 Рг - 250000
F - 250000 F - 180000 F - 210000
Общее время анализа, мин 12.5 27.0 22.0
Разрешение соседних пиков >1.34 > 1.25
Состав ведущего электролита 25 мМ фосфорная к-та 5 мМ тетраборат натрия 25 мМ фосфорная к-та
10 мМ ДДСН 50 мМ ДДСН 10 мМ ДДСН
4.5 М мочевина 20% метанола 15% метанола
Условия ввода пробы, Кварц: Ьэфф/Ьобщ = 30/80 см; 75 мкм, Ввод: 60 мбар с
величина рабочего напряже- и: = -25 кВ и: = +22 кВ и: = -25 кВ
ния, параметры капилляра I: = -28 мкА I: = +28 мкА I: = -33.5 мкА
Примечание Полное разделение всех Можно разделить все компоненты смеси,
стероидов кроме 17-ОНРг и DOC
происходит за счет различных коэффициентов распределения между полярным водным буфером и неполярными мицеллами.
Наиболее эффективный способ повлиять на электрофоретические характеристики разделяемых веществ и скорость электроосмотического потока - это варьирование рН и концентрации рабочего электролита. При уменьшении рН и увеличении концентрации наблюдается снижение скорости ЭОП, связанное с уменьшением электрокинетического потенциал
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.