ЖУРНАЛ АНАЛИТИЧЕСКОЙ ХИМИИ, 2007, том 62, № 11, с. 1181-1185
^=ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 543.867:543.544
ОПРЕДЕЛЕНИЕ a-ТОКОФЕРОЛА И ЭРГОКАЛЬЦЕФЕРОЛА МЕТОДОМ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
© 2007 г. Е. В. Бородина, Т. А. Китаева, Е. Ф. Сафонова, В. Ф. Селеменев, А. А. Назарова
Воронежский государственный университет, химический факультет 394012 Воронеж, Университетская пл., 1 Поступила в редакцию 17.05.2006 г., после доработки 25.10.2006 г.
Разработана методика определения а-токоферола (витамин Е) и эргокальцеферола (витамин D2) в растительных маслах, включающая раздельное выделение витаминов экстракцией органическими растворителями после щелочного гидролиза растительного масла в соответствии с ГОСТ 30417, разделение экстрактов на пластинах Sorbfil (неподвижная фаза - силикагель зернением 5-12 мкм) при элюировании витамина Е смесью (7 : 1) октан-диэтиловый эфир, витамина D2 - смесью (4 : 1) тетрахлорметан-диэтиловый эфир, проявление зон конц. HNO3 (а-токоферол) или конц. H2SO4 (эр-гокальцеферол), сканирование пластин и обработку изображения компьютерной программой Sorbfil Videodensitometer. Градуировочные графики линейны в диапазонах 2.50-15 и 15-50 мг/мл а-токо-ферола, 0.08-0.13 мг/мл эргокальцеферола. Методика применена для определения витаминов в масляном экстракте череды и в масле из виноградных косточек.
Важными биологически активными веществами в жизнедеятельности организма являются а-токоферол (витамин Е) и эргокальцеферол (витамин Ъ2) (рис. 1). Токоферолы поддерживают структурную целостность клеток, предотвращая окисление ненасыщенных жирных кислот - важнейшего компонента клеточных мембран, предохраняют каротиноиды, витамин А и другие вещества от окислительного распада и служат в качестве консервантов для них [1]. Основные функции витамина Ъ2 в организме связаны с обеспечением транспорта ионов кальция и фосфора через биологические мембраны.
В настоящее время описаны методики определения этих веществ методами ВЭЖХ [2-7], газожидкостной хроматографии [8], кулонометрии и вольтамперометрии [9]. Метод тонкослойной хроматографии (ТСХ) является доступным и экспрессным, требует менее дорогого оборудования, чем метод ВэЖх. Поэтому применение метода ТСХ для определения этих соединений представляет определенный интерес и может использоваться в пищевой и фармацевтической промышленности.
Целью настоящего исследования является выбор оптимальных условий определения а-токо-ферола и эргокальцеферола в растительных маслах методом тонкослойной хроматографии.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Объектами исследования служили масляный экстракт череды и масло из виноградных косточек. В качестве стандартных образцов применяли
а-токоферол и эргокальцеферол производства "ICN Biomedical" (США).
а-токоферол и эргокальцеферол выделяли экстракцией органическими растворителями после щелочного гидролиза растительного масла в соответствии с ГОСТом [11]. Для выделения а-токоферола в конической колбе взвешивали (3.0000 ± 0.0002) г растительного масла. Добавляли (0.2000 ± 0.0005) г аскорбиновой кислоты и 30 мл свежеприготовленного раствора КОН с концентрацией 2 М. Смесь нагревали с обратным холодильником в кипящей водяной бане в течение 15 мин, начиная с момента закипания раство-
(а)
CH
OH
CH
CH
(б)
CH3
CH3
HO
CH3 H3C' "CH3
Рис. 1. Химические формулы а-токоферола (а) и эргокальцеферола (б).
Яркость, усл. ед. 2000 г
1500 1000 500 0
-500
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0 Rf
Определение проводили на пластинах SorbШ (Краснодар) размером 10 х 10 см, сорбент-силика-гель зернением 5-12 мкм. Расстояние, пройденное элюентом от линии старта до линии фронта составляло -8 см. В качестве проявителя при определении витамина Е применяли конц. Н№03, витамина D2 - конц. H2SO4. Хроматографические зоны идентифицировали по относительной скорости перемещения вещества на пластине (КД Оптимальным элюентом для определения витамина Е был октан-диэтиловый эфир (7 : 1), для определения витамина D2 - тетрахлорметан-ди-этиловый эфир (4 : 1).
Хроматографические параметры рассчитывали по формулам [9]:
Рис. 2. Аналоговая кривая хроматографирования раствора а-токоферола (с = 15 мг/мл) в элюирующих системах: (8 : 2) бензол-этилацетат (1); (1 : 1) бензол-петролейный эфир (2), хлороформ (5), (37 : 3) гексан-этилацетат (4), (7 : 1) октан-диэтиловый эфир (5).
ра в колбе. Содержимое колбы охлаждали и количественно переносили в делительную воронку тремя порциями дистиллированной воды общим объемом 100 мл. Неомыляемые вещества экстрагировали тремя порциями по 60 мл диэтилового эфира. Объединенный эфирный экстракт промывали в делительной воронке до нейтральной реакции промывных вод по фенолфталеину. Промытый эфирный экстракт помещали в сухую колбу и высушивали над безводным №^04, затем фильтровали через бумажный фильтр. Колбу и фильтр промывали тремя порциями по 10 мл диэтилового эфира. Эфир из объединенного фильтрата отгоняли на роторном испарителе до объема 0.5-0.6 мл. Сухой остаток растворяли в этаноле и хроматографировали.
Выделение эргокальцеферола проводили, основываясь на его хорошей растворимости в этаноле. На аналитических весах взвешивали (3.0000 ± ± 0.0002) г анализируемого масла и экстрагировали тремя порциями по 50 мл 96%-ного этанола. Этанол отгоняли на роторном испарителе до объема 0.5-0.6 мл. Сухой остаток взвешивали, растворяли в этаноле, с точно известной концентрацией, хроматографировали.
Zx
Rf -Z; zf
-2 Z x
-Z;
N --f
где Zx - расстояние, пройденное веществом от точки нанесения пробы до центра зоны, см; H -высота, эквивалентная теоретической тарелке; Gx - стандартное отклонение дисперсии пятна по оси X, см; N - число теоретических тарелок.
Количественное определение проводили методом абсолютной градуировки. Сразу же после проявления хроматографических зон, пластины сканировали, а полученные изображения обрабатывали компьютерной программой Sorbfil Videodensitometer. Принцип работы программы состоит в построении аналоговой кривой хроматограм-мы по отклонению яркости пятен от яркости фона с последующим нахождением пиков на этой кривой и расчетом их площади. В результате были получены треки в координатах Rf - интенсивность (рис. 2). Максимум на кривой соответствует центру зоны, площадь под кривой - площади пятна, а высота пика - интенсивности хроматографи-ческой зоны.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Наибольшее влияние на разделения веществ в тонком слое сорбента оказывает растворитель. Для определения а-токоферола в литературе рекомендуются различные системы: бензол-этил-ацетат (8 : 2), бензол-петролейный эфир (1 : 1), хлороформ, гексан-этилацетат (37 : 3) [1, 11, 13].
Таблица 1. Хроматографические параметры а-токоферола в различных элюирующих системах
< Элюент Rf H, мм N
1 Бензол-этилацетат(8 : 2) 0.85 0.98 80
2 Бензол-петролейный эфир (1 : 1) 0.80 0.78 106
3 Хлороформ 0.85 0.55 156
4 Гексан-этилацетат (37 : 3) 0.53 0.34 253
5 Октан-диэтиловый эфир (7 : 1) 0.30 0.59 140
Таблица 2. Хроматографические параметры эргокальцеферола в различных элюирующих системах
№ Элюент Rf H, мм N
1 Тетрахлорметан-диэтиловый эфир (4 : 1) 0.23 0.71 101.4
2 Гексан-диэтиловый эфир (4 : 1) 0.11 1.00 76.0
3 Октан-диэтиловый эфир (4 : 1) 0.09 2.29 33.2
4 Гексан-этилацетат (9 : 1) - - -
5 Бензол-петролейный эфир (4 : 1) - - -
Нами были исследованы предложенные системы, а также изучена новая система растворителей -октан-диэтиловый эфир (7 : 1). Для каждой системы растворителей рассчитаны величины: относительная скорость перемещения вещества, высота, эквивалентная теоретической тарелке, число теоретических тарелок (табл. 1). Видно, что наибольшие значения N, а, следовательно, и наибольшая эффективность хроматографирования для токоферола наблюдается в системах 3, 4 и 5.
Хроматографические зоны имеют овальную форму, соответствующую вогнутой (система 1, 3) или выпуклой (система 2, 4) изотермам сорбции (рис. 2), что затрудняет дальнейшую обработку полученных хроматограмм с помощью компьютерной программы Sorbfil Videodensitometer. Хроматографические зоны в системе 5 имеют форму, соответствующую линейной изотерме сорбции, что является необходимым условием дальнейшей корректной обработки хроматограмм. Поэтому оптимальным элюентом является система 5. Кроме того, в системе 5 (а также в системе 4) значения Rf являются оптимальными (находятся в диапазоне 0.3-0.5) [14].
Известно несколько элюирующих систем для определения эргокальцеферола [12]. Нами исследованы предложенные авторами [12] и новые (№ 1 и № 2 в табл. 2) элюирующие системы. Для каждой системы растворителей также рассчитаны величины Rf, H, N (табл. 2). Системы 4 и 5 не позволили провести определение эргокальцеферола. Видно, что наибольшая эффективность хроматографирования и лучшее качество зон для эргокальцеферола наблюдается в предложенной нами системе 1, где форма пятна соответствует линейной изотерме сорбции.
Кроме элюирующей системы на процесс хроматографирования также влияет количество наносимой пробы. Пределы обнаружения а-токофе-рола и эргокальцеферола равны 2.50 и 0.08 мг/мл соответственно.
Для а-токоферола в качестве проявителя рекомендуются 5%-ный этанольный раствор молибдо-фосфорной кислоты [1], 1%-ный раствор AgNO3, смесь хлорида железа(Ш) и ферроцианида калия [13]. Наиболее универсальным проявителем является конц. HNO3, так как данный проявитель
является специфичным (в отличие от раствора молибдофосфорной кислоты), экономически целесообразным (в отличие от раствора AgNO3) и обладает достаточной чувствительностью для обнаружения токоферолов (в отличие от смеси хлорида железа(Ш) и ферроцианида калия).
Для эргокальцеферола в качестве проявителя рекомендуются конц. H2SO4, смесь 1 мас. % ванилина и 50 мас. % H3PO4 [13]. Наиболее эффективным проявителем оказался раствор конц. H2SO4: он обеспечивает достаточно высокую контрастность зон эргокальциферола и фона пластины, обнаруженные пятна витамина D2 не обесцвечиваются при хранении хроматограмм (в отличие от смеси ванилина и H3PO4), что важно для дальнейшей обработки пластин в количественном анализе с применением компьютерной программы "Sorbfil Videodensit
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.