ш
УДК 57.083.3:579.861.2
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТОКСИНОВ STAPHYLOCOCCUS AUREUS МЕТОДОМ ИММУНО-ПЦР
© 2014 г. А. В. Маерле*, #, Д. Ю. Рязанцев**, О. А. Дмитренко***, Е. Э. Петрова**, Р. Л. Комалева**, И. В. Сергеев*, Д. Ю. Трофимов****, С. К. Завриев**
*ФГБУ "ГНЦИнститут иммунологии" ФМБА России, 115478, Москва, Каширское шоссе, д. 24, корп. 2 **ФГБУНИнститут биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН,
117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 ***ФГБУ "Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Н.Ф. Гамалеи Министерства здравоохранения РФ", Москва **** ЗАО "НПФДНК-Технология", Москва Поступила в редакцию 04.12.2013 г. Принята к печати 23.03.2014 г.
Разработаны высокочувствительные тест-системы для определения двух стафилококковых токсинов: энтеротоксина А (SEA) и токсина синдрома токсического шока (TSST), основанные на методе иммуно-ПЦР. Ключевым элементом разработанных систем явилось получение надмолекулярных комплексов бисбиотинилированных олигодезоксинуклеотидов со стрептавидином, которые были использованы в качестве ДНК-метки. Исследования специфичности разработанных тест-систем показали отсутствие перекрестных реакций при определении SEA и TSST. Чувствительность определения этих токсинов в супернатантах культур S. aureus составила не менее 10 пг/мл.
Ключевые слова: иммуно-ПЦР, Staphylococcus aureus, надмолекулярные комплексы.
Б01: 10.7868/8013234231405011Х
ВВЕДЕНИЕ
Иммуно-ПЦР является высокочувствительным методом обнаружения антигенов различной природы, таких как специфические антитела, ци-токины, онкомаркеры, прионы, вирусные и бактериальные антигены, в том числе токсины [1]. Метод был предложен Сано с соавторами [2] в 1992 г. Главной его идеей было использование определенного фрагмента ДНК (ДНК-метки) и полимеразной цепной реакции (ПЦР) для детекции взаимодействия "антиген—антитело". Амплификация ДНК-метки, связанной со специфическим антителом, с последующей детекцией продуктов амплификации позволяет достигнуть большей чувствительности определения антигена по сравнению с твердофазным ИФА. Основными путями развития метода были подбор твердой фазы для иммобилизации антител или антигенов, выбор оптимальной ДНК-метки и метода связывания ДНК-метки с детектирующим антителом.
Сокращения: АПК — антигенпрезентирующие клетки; Bt — биотин; SEA — стафилококковый энтеротоксин А; Str — стрептавидин; TSST — токсин синдрома токсического шока.
#Автор для связи (тел.: +7 (926) 166-47-20, эл. почта: maerle@yandex. ru).
Стафилококки (Staphylococcus aureus и др.) продуцируют большое количество токсинов, из которых можно выделить группу, проявляющую свойства суперантигенов. Это стафилококковые энтеротоксины (SEA, SEB, SEC и остальные, вплоть до SEV), а также токсин синдрома токсического шока (TSST) [3]. Обычные антигены усваиваются антигенпрезентирующими клетками (АПК) и подвергаются процессингу с последующей презентацией антигенных пептидов в комплексе с молекулами главного комплекса гистосовместимо-сти на поверхности АПК. Эти комплексы распознаются Т-клеточными рецепторами Т-лимфоцитов, что ведет к дальнейшему развитию специфического иммунного ответа. При этом стимуляции подвержена только одна из 105—106 наивных Т-клеток [4]. Суперантигены не претерпевают процессинг в цитоплазме АПК, однако способны напрямую связывать молекулы Т-клеточных рецепторов на CD4-позитивных T-лимфоцитах и молекулы главного комплекса гистосовместимости II класса на поверхности АПК [5]. Таким образом, игнорируется специфичность Т-лимфоцитов. За счет такой неспецифической стимуляции Т-лимфоцитов происходит большой выброс провоспалительных цитокинов, так как уровень стимулированных Т-лимфоцитов
может достигать 20% от их общего числа [6]. Суперантигены играют важную этиопатогенетиче-скую роль в развитии целого ряда различных тяжелых патологических состояний человека, таких как менструальный и неменструальный синдром токсического шока, стафилококковая пневмония и эндокардит. Недавно описана взаимосвязь суперантигенов с развитием стафилококковой молниеносной пурпуры и синдромом экстремальной гипертермии. Пищевые отравления, вызванные S. aureus, являются синдромами, при которых суперантигены стафилококков (A, B, C, D, E и G) являются основной причиной заболевания [7, 8]. Большинство тяжелых случаев развития синдрома токсического шока (СТШ) обусловлено суперантигенными свойствами TSST SEB и SEC. В свою очередь SEA служит главной причиной возникновения стафилококковых пищевых отравлений [9].
Основными лабораторными методами выявления стафилококковых токсинов являются ИФА и метод латексной агглютинации. Однако чувствительность данных методов не превышает 30 и 500 пг/мл соответственно [10—13]. Увеличение чувствительности определения стафилококковых токсинов возможно за счет использования метода иммуно-ПЦР, что было показано в работах Фишера c соавт. [14] и Райковца c соавт. [15]. В этих работах предел обнаружения стафилококкового энтеротоксина А (SEA) и стафилококкового эн-теротоксина B (SEB) составил 100 [14] и 10 пг/мл [14, 15] соответственно.
Настоящая работа посвящена оптимизации методики иммуно-ПЦР, разработанной нами ранее [16] и детекции SEA и TSST в образцах супер-натантов клеточных культур золотистого стафилококка из клинических изолятов.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
На сегодняшний день не существует "золотого" стандарта при разработке тест-систем на основе метода иммуно-ПЦР. Ключевыми моментами являются: выбор твердой фазы для иммобилизации связующих антител, выбор блокирующих компонентов и способа введения ДНК-метки, а также минимизация фонового сигнала. Результат данной работы — это метод, разработанный на основе иммуно-ПЦР с использованием в качестве метки надмолекулярных комплексов одноцепо-чечной ДНК со стрептавидином.
В работе использованы пары моноклональных антител к различным эпитопам токсинов SEA и TSST. Первые (связывающие) антитела обеспечивают захват антигена из образца и его иммобилизацию на твердой фазе, после чего вторые (детектирующие) биотинилированные антитела связываются с другим эпитопом соответствующего токсина. ДНК-метка, несущая биотин, посредством стрепта-
видина связывается с образовавшимся иммунологическим комплексом и может быть обнаружена методом ПЦР.
Твердая фаза. В качестве твердой фазы могут быть использованы пробирки и планшеты для твердофазного ИФА и ПЦР [1], обладающие повышенной сорбцией белка, планшеты с предварительно сорбированным стрептавидином [17], связывающим первые (связывающие) антитела, модифицированные биотином, магнитные частицы [1, 18].
В качестве твердой фазы для иммобилизации первых (связывающих) антител нами был выбран поликарбонатный планшет для проведения ПЦР (Greiner, Германия). Поверхность лунок этого планшета обладает достаточной емкостью сорбции антител. Нами были подобраны оптимальные условия для модификации лунок планшета связывающими антителами: инкубация 40 мкл раствора связующих антител с концентрацией 20 мкг/мл в буфере PBS в течение 16 ч при +4°С. V-Образная форма лунок планшета позволяет напрямую использовать его в ПЦР-амплификаторе, что избавляет от необходимости отщепления ДНК-метки с последующим переносом раствора из планшета в пробирки для проведения ПЦР.
ДНК-метка. В качестве ДНК-метки нами были использованы надмолекулярные комплексы [(биотин)ДНК(биотин)-стрептавидин]в [16, 19], условия получения которых были разработаны в настоящей работе. Для этого были синтезированы одноцепочечные олигодезоксинуклеотиды (oligo(N)) длиной 60 нт, несущие одну (Bt-oli-go(N) и две молекулы биотина (Bt2-oligo(N)). Как было показано в предыдущей работе [16], именно одноцепочечный олигонуклеотид в качестве ДНК-метки позволяет добиться большей чувствительности метода по сравнению с двухцепо-чечными ДНК-метками.
Для использования в иммуно-ПЦР конъюга-тов олигодезоксинуклеотидов со стрептавидином были подобраны и оптимизированы условия их получения. Определяющим критерием отбора была минимальная достоверно определяемая концентрация SEA в солевом Трис-буфере (TBS). Получены конъюгаты Bt2-oligo(N) со стрептавидином с различным молярным соотношением компонентов (рис. 1, дорожки 1—3) и конъюгат монобиоти-нилированного олигонуклеотида Bt-oligo(N) со стрептавидином (рис. 1, дорожка 4); характеристики полученных конъюгатов представлены в табл. 1.
Образование продукта с электрофоретической подвижностью, эквивалентной олигонуклеотиду длиной ~350 п.о., во всех трех конъюгатах Bt2-oli-go(N)—стрептавидин (№№ 1—3, табл. 1) с разным молярным соотношением компонентов подтверждает формирование надмолекулярных комплек-
сов [(биотин)ДНК(биотин)-стрептавидин]в. Образование надмолекулярных комплексов приводит к увеличению количества нуклеотидной метки, связанной с одним антителом, что позволяет достичь большей чувствительности по сравнению с конъ-югатом № 4. На основании сравнения результатов, полученных при использовании конъюгатов 1—4 в иммуно-ПЦР, для дальнейшей работы был выбран конъюгат № 2, позволивший достичь большей чувствительности определения SEA в TBS (табл. 1). Учитывая, что во всех трех случаях использования бисбиотинилированного олигонук-леотида образуются надмолекулярные комплексы с одинаковой электрофоретической подвижностью, можно предположить, что снижение чувствительности определения SEA в TBS при использовании конъюгатов № 1 и № 3 по сравнению с эквимолярным конъюгатом № 2 связано с наличием определенной доли свободного стрептавидина в конъюгате № 1 (избыток стрептавидина) и блокировании части свободных валентностей стрепта-видина в конъюгате № 3 (избыток Bt2-oligo(N)).
Блокирующие агенты. С целью уменьшения уровня неспецифического связывания ДНК-метки и вторых антител на поверхности твердой фазы были подобраны условия блокирования неспецифической сорбции. В качестве блокирующих компонентов были использованы бычий сывороточный альбумин (BSA), ДНК спермы лосося и сухое обезжиренное молоко. Было показано, что в нашей системе блокирование раствором BSA в присутствии или в отсутствие ДНК спермы лосося или сухого молока о
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.