ЖУРНАЛ АНАЛИТИЧЕСКОЙ ХИМИИ, 2007, том 62, № 2, с. 153-157
^=ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 547.963.32: 543.426
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЦИПРОФЛОКСАЦИНА И ЭНРОФЛОКСАЦИНА МЕТОДОМ СЕНСИБИЛИЗИРОВАННОЙ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ ЕВРОПИЯ В ПРИСУТСТВИИ ВТОРОГО ЛИГАНДА И МИЦЕЛЛ АНИОННЫХ ПАВ
© 2007 г. С. Н. Штыков, Т. Д. Смирнова, Ю. Г. Былинкин, Н. В. Калашникова, Д. А. Жемеричкин
Саратовский государственный университет, химический факультет 410012 Саратов, ул. Астраханская, 83 Поступила в редакцию 05.09.2005
Изучено влияние поверхностно-активных веществ и второго лиганда на флуоресцентные свойства бинарных хелатов европия(Ш) с ципрофлоксацином и энрофлоксацином. Показано, что интенсивность флуоресценции хелатов европия с антибиотиками в присутствии 1,10-фенантролина возрастает в 4 раза, а в мицеллах додецилбензолсульфоната натрия еще в 5 раз. Предел обнаружения ци-профлоксацина и энрофлоксацина составляет 2.3 х 10-7 М. Разработанные методики определения антибиотиков апробированы на фармацевтическом препарате "Ципролет" и плазме крови.
Ципрофлоксацин (ЦФ) и энрофлоксацин (ЭФ) относятся к группе фторхинолонов (ФХ) - производных 4-хинолон-3-карбоновой кислоты и
О
Ципрофлоксацин О
Энрофлоксацин
являются третьим поколением известных антибактериальных средств ряда хинолонов, широко используемых в клинической практике. Введение фтора в положение 6 и пиперазина в положение 7 хинолонового цикла позволило получить соединения с очень широким спектром антибактериального действия, относительно малой токсичностью, низкой способностью вырабатывать лекарственную устойчивость у бактерий. ФХ также используют в качестве добавок к кормам в животноводстве [1], птицеводстве [2], рыбном хозяйстве [3], однако превышение определенного уровня его содержания в пищевой продукции может вызвать аллергические реакции у потребителя.
Известно, что зависимость бактерицидного действия хинолонов от их концентрации носит "парадоксальный характер", суть которого заключается в увеличении количества выживших бактерий при достижении определенной концентрации препарата в организме [4]. При действии ФХ количество выживших бактерий меньше, однако и для них эта необычная зависимость сохраняется. В этой связи для достижения положительного результата в лечебной практике и профилактике заболеваний в животноводстве и птицеводстве необходим контроль за содержанием ЦФ и ЭФ в фармпрепаратах, биологических жидкостях, тканях организма и пищевой продукции.
В зависимости от объекта анализа, диапазона определяемых концентраций для определения ФХ применяют различные методы. Фармакопейный метод [5] определения основан на микробиологическом тесте, включающем диффузию антибиотика в агар (питательную среду) и сравнение угнетения роста тест-микроорганизма определенными концентрациями испытуемого препарата со стандартами антибиотика. Минимально определяемая концентрация составляет 0.05 мкг/мл. Основными недостатками метода являются низкая избирательность, продолжительность и трудоемкость определения.
В химическом анализе для определения ФХ чаще всего используют высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ). Описано хро-матографическое определение ЦФ и ЭФ в коровьем молоке [6, 7], биологических жидкостях [6, 8] с использованием УФ и флуориметрического детекторов. В качестве неподвижной фазы используют Сферисорб [6], Нуклеосил С18 [8], в качестве подвижной фазы - токсичный метанол, а
250 270 290 310 330 350
X, нм
Рис. 1. Спектры поглощения ЦФ (ЭФ) (1), Еи3+-ЦФ (ЭФ) (2), Фен (3).
сЦФ (ЭФ) = 1 х 10-5 М, с з+ = 2 х 10-4 М, сФен = 1 х
х 10-5 М, рН 9.0.
также ацетонитрил. Время разделения компонентов 15-20 мин. Чувствительность определения методом ВЭЖХ зависит от способа детектирования. При использовании флуориметрического детектора диапазон определяемых концентраций наиболее широкий и составляет 1 х 10-8-1 х 10-4 М.
Спектрофотометрический метод определения ФХ основан на образовании ими комплексов с ионами меди(П) или железа(Ш) [9, 10], а также ионных ассоциатов с органическими реагентами ряда сульфофталеина [11]. Этим методом определяют от 3 до 25 мг/мл ЦФ, причем, главным образом, содержание основного вещества в фармацевтических препаратах - таблетках, глазных каплях. Недостатком метода является невысокая чувствительность, а в экстракционном варианте -использование токсичных органических растворителей.
Собственную флуоресценцию ФХ используют для их определения в биологических объектах после предварительного извлечения органическим растворителем [12]. Однако наибольший интерес представляет флуориметрическое определение фторхинолонов, основанное на сенсибилизированной флуоресценции лантанидов. Так, для определение ЦФ и ЭФ в мышечных тканях цыплят используют их комплекс с тербием(Ш), солюбили-зированный в мицеллах лаурилсульфата натрия, предел обнаружения 10-50 мг/кг [13]. Предложен метод определения в биологических жидкостях, основанный на образовании смешанолигандного комплекса тербия с трифенилфосфиноксидом, предел обнаружения 1.2 пикомоль [14].
Использование сенсибилизированной флуоресценции дает ряд преимуществ перед другими методами анализа, заключающихся в простоте методики, широком диапазоне определяемых концентра-
ций, высокой селективности определения, низких пределах обнаружения, позволяющих не только определять указанные ФХ, но и изучать их фар-макокинетику в организме.
Цель работы - изучение совместного действия второго лиганда и мицелл ПАВ на сенсибилизированную флуоресценцию европия и тербия и применение изученных систем для определения ЦФ и ЭФ в фармацевтических и биологических объектах.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Аппаратура. Спектры возбуждения и флуоресценции получали на спектрофлуориметре СДЛ-1 (ЛОМО, С.-Петербург). Интенсивность флуоресценции измеряли на люминесцентном фотометре ФЛ-УХЛ 4.2 с источником возбуждения - лампой КГМ-12-100-2, при ширине щели -3, полностью открытой диафрагме [светофильтр № 1 (330 нм)] в кварцевой кювете с толщиной слоя 1 см. Спектры поглощения получали на регистрирующем спектрофотометре СФ-46 с встроенной микропроцессорной системой. Кислотность контролировали на рН-метре рН-673М со стеклянным индикаторным и хлоридсеребряным электродом сравнения.
Реагенты. Стандартные растворы ЦФ и ЭФ ("ISN-Biomedical") готовили на бидистилляте по точной навеске. Растворы хлоридов европия и тербия (ч.д.а.), исходной концентрации 1 х 10-2 М готовили также на бидистилляте и стандартизовали комплексонометрически с индикатором кси-леноловым оранжевым. Исходные водные растворы 1,10-фенантролина солянокислого (Фен) ("Chemapol") и триоктилфосфиноксида (ТОФО) ("Sigma") квалификации ч.д.а. имели концентрацию 1.0 х 10-2 М. Производные 1,10-фенантроли-на-4,7-дифенил-1,10-фенантролин ("Fluka") и 2,9-диметил-4,7-дифенил-1,10-фенантролин ("Fluka") содержали не менее 98% основного вещества. Исходные растворы производных Фен в 0.1 М HCl имели концентрацию 1.0 х 10-3 М.
Ацетатно-аммиачные буферные растворы готовили из растворов 2 М CH3CÖOH и 2 М NH3 (квалификации х.ч.). Использовали препараты анионных - додецилбензолсульфонат натрия (ДДБС) ("Sigma"), гептилсульфонат натрия (ГС) (НПО "Диагностикум"), додецилсульфат натрия (ДДС) ("AppliChem"), катионных - хлорид цетилпириди-ния (ЦП) ("Merck"), неионных - оксиэтилирован-ный спирт Бридж-35 ("Merck"), оксиэтилирован-ный алкифенол Тритон Х-100 ("Merck") ПАВ, которые содержали более 98% основного вещества.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Спектры поглощения, возбуждения и флуоресценции ципрофлоксацина и энрофлоксацина.
I, отн. ед. 1
500
550
600
650
X, нм
I, отн. ед. 1
0 600
605 610 615 620
625 630 X, нм
Рис. 2. Спектры флуоресценции хелата ТЬ3+-ЦФ (1) и Еи3+-ЦФ (2) в мицеллярном растворе ДДБС. Сцф = = 1 х 10-5 М, с_ 3+ = 2 х 10-4 М, с_ 3+ = 1 х 10-3 М,
Ей »-2 1
ть
СДДБС = 1 х 10-2 М, рН 9.0.
Рис. 3. Спектры флуоресценции систем Еи3+-ЦФ (1), Еи3+-ЦФ - ТОФО (2), Еи3+-ЦФ - Фен (3), Еи3+-ЦФ -Фен - ДДБС (4). с 3+ = 2 х 10-4 М, сФен = 1 х 10-3 М,
Ей
сцф = 1 х 10 5 М, стофо = 5 х 10 5 М, сддбс = 1 х 10"
-2
М,
рН 9.0.
0
Спектры поглощения ЦФ и ЭФ, хелатов европия с ЦФ и Фен представлены на рис. 1. Видно, что спектры обоих антибиотиков практически идентичны, так как молекула ЭФ отличается от ЦФ только наличием этильного радикала при атоме азота пиперидинового цикла. Молярные коэффициенты поглощения наиболее интенсивных коротковолновых полос поглощения ЦФ и ЭФ практически одинаковы и равны (3.4 ± 0.1) х 104. При взаимодействии антибиотиков с европием или тербием по карбоксихинонной группировке длинноволновая полоса спектра смещается на 10 нм ба-тохромно, при этом немного увеличивается све-топоглощение в области коротковолновой полосы реагентов.
ЦФ и ЭФ обладают собственной флуоресценцией, характеризующейся Хвозб = 275 нм и Хфл = = 440 нм, что согласуется с данными других авторов [6, 8]. Для повышения квантового выхода флуоресценции ФХ обычно используют эффект сенсибилизации флуоресценции тербия(Ш). При этом кроме квантового выхода более, чем на 100 нм увеличивается и стоксов сдвиг флуоресценции, так как поглощает свет молекула антибиотика, а излучает ион тербия(Ш). Считается, что для определения ФХ использование тербия(Ш) предпочтительнее, чем европия(Ш), так интенсивность флуоресценции хелатов тербия(Ш) выше [15].
Нами показано, что в случае ЦФ и ЭФ в аце-татно-аммиачном буферном растворе, наоборот, более интенсивно флуоресцирует хелат евро-пия(Ш) (рис. 2). При этом дополнительно на 70 нм увеличивается и стоксов сдвиг. Соотношение энергии триплетного состояния ЦФ (21275 см-1) и резонансного уровня 501 европия (19020 см-1) позволяет реализовать перенос энергии возбуждения
на ион металла с последующей безызлучательной дезактивацией на возбужденное состояние европия 500 (17260 см-1) [15]. Результатом дальнейшего энергетического перехода 5Ь0 —► 1F2 является узкая полоса излучения при 615 нм, характерная для европия(Ш).
Влияние второго лиганда. Как известно, влияние второго лиганда на интенсивность сенсибилизированной флуоресценции лантанидов связано с вытеснением из координационной сферы иона металла остаточных молекул гидра
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.