ЖУРНАЛ АНАЛИТИЧЕСКОЙ ХИМИИ, 2013, том 68, № 2, с. 170-174
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 543.544, 543.51
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЦИСПЛАТИНА В ПЛАЗМЕ КРОВИ МЕТОДОМ ХРОМАТО-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ
© 2013 г. Д. В. Ярошенко*, А. В. Григорьев*, А. А. Сидорова*, Л. А. Карцова**
*Санкт-Петербургский государственный политехнический университет, ЦКП "Аналитическая спектрометрия'
195220 Санкт-Петербург, ул. Гжатская, 27 **Санкт-Петербургский государственный университет 198504 Санкт-Петербург, Петродворец, Университетский просп., 26 Поступила в редакцию 16.11.2011 г., после доработки 26.04.2012 г.
Разработана методика определения цитотоксического противоопухолевого препарата цисплатина в плазме крови методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ) с масс-спектрометрическим детектированием. Оптимизированы условия получения производного цисплатина с диэтилдитиокарбаматом натрия и отделения его от матрицы методом твердофазной экстракции на гидрофильно-липофильном сорбенте Oasis HLB. Предел количественного определения цисплатина составляет 10 нг/мл. Методика аттестована согласно международным требованиям для биоаналитических методов и применена для изучения фармакокинетики при проведении изолированной перфузии легкого цисплатином.
Ключевые слова: цисплатин, диэтилдитиокарбамат натрия, ВЭЖХ-МС, твердофазная экстракция, плазма крови.
DOI: 10.7868/S0044450213020163
Одной из главных проблем химиотерапии при онкологических заболеваниях является высокая токсичность противоопухолевых препаратов. Для уменьшения их негативного воздействия на здоровые клетки организма и увеличения эффективности терапии разрабатываются различные способы локального воздействия на пораженный опухолью орган. В качестве одной из таких процедур в НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова была предложена изолированная перфузия легкого раствором цисплатина [1], обеспечивающая целенаправленное воздействие лекарства и предотвращающая проникновение токсичного препарата в системный кровоток и здоровые ткани организма.
Цисплатин (ЦСП) применяется при лечении таких заболеваний, как рак легкого, мочевого пузыря, толстой кишки и др. [2, 3]. Он является ци-тотоксическим средством алкилирующего действия, обладает противоопухолевой активностью:
си ^И3 'и' 3
Описаны различные методы количественного определения ЦСП: атомно-абсорбционная спектроскопия (предел обнаружения 0.3—0.6 мкг/мл) [4, 5], мицеллярная электрокинетическая капиллярная хроматография с УФ-детектированием (предел обнаружения 0.6—0.9 мкг/мл) [6, 7]. Наи-
более распространенным методом определения ЦСП в биологических объектах является обра-щенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография с ультрафиолетовым детектированием. Поскольку ЦСП очень слабо поглощает в УФ-области спектра, использовали пред- и после-колоночное получение производных с диэтилди-тиокарбаматом натрия (ДДТК) [8], гидросульфитом натрия [9], о-фенилендиамином [10], 4-метил-2-тиоурацилом [11], бис(салицилальдегид)тетрамети-лэтилендиимином [12], 2-ацетилпиридин-4-фе-нил-3-тиосемикарбазоном [13] и др.
Известны примеры определения ЦСП методом, сочетающим ВЭЖХ и масс-спектрометрию (ВЭЖХ-МС), где его детектируют в виде аддуктов
с ионами №+, К+, МИ+, продуктов гидролиза [Р1С1(И20)(МИ3)2]+ и [Р1(И20)2(МИ3)2]2+ [12], производных с ДДТК [8, 13—15] или глутатионом [5]. Высокочувствительный метод масс-спектро-метрии с индуктивно-связанной плазмой [16] не подходит для решения фармакокинетических задач, поскольку в этом случае возможно определение лишь общего содержания платины в биообразце, что не годится при комбинированной терапии. При исследовании фармакокинетики лекарственных препаратов наиболее целесообразно сочетание обращенно-фазовой (ОФ) ВЭЖХ и масс-спектрометрии с электрораспылительной ионизацией. Хроматографическая составляющая такого подхода позволяет добиться
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЦИСПЛАТИНА В ПЛАЗМЕ КРОВИ
171
высокой селективности разделения аналита и мешающих компонентов матрицы, а масс-спектро-метрическое детектирование обеспечивает высокую чувствительность. Метод позволяет проводить серийные анализы с хорошей воспроизводимостью.
Цель данного исследования — разработка методики определения концентрации ЦСП методом ОФ ВЭЖХ-МС с электрораспылительной ионизацией в плазме крови после предварительного получения производных с ДДТК и изучение фармакокинетики проникновения препарата в системный кровоток при проведении изолированной перфузии легкого.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Реагенты и материалы. Для приготовления подвижной фазы и проведения пробоподготовки использовали ацетонитрил для ВЭЖХ (Biosolve), метанол для ВЭЖХ (Merck), CH3COONa (Sigma Al-drich), ледяную CH3COOH х.ч. (ВЕКТОН), HCl х.ч. (ВЕКТОН), CCl4 х.ч. (ВЕКТОН), этилацетат х.ч. (ВЕКТОН), диэтилдитиокарбамат натрия три-гидрат х.ч. (ВЕКТОН), NaOH (Merck), воду биди-стиллированную (очищенную с помощью системы Milli Q Synthesis), патроны для твердофазной экстракции Waters OASIS HLB (30 мг, 1 мл).
Аппаратура. Работу выполняли на хромато-масс-спектрометре Agilent 1100, состоящем из изократического насоса (G1310A), автоматического дозатора (G1329A), термостата (G1330A) и масс-спектрометрического детектора с электрораспылительной ионизацией и квадрупольным масс-анализатором (G1946A). Доказательство структуры образующегося комплекса выполняли на хромато-масс-спектрометре Shimadzu, в котором сочетаются жидкостная хроматография и времяпролетная масс-спектрометрия с ионной ловушкой. Разделение проводили на колонке (100 х 2.0 мм, 3 мкм) YMC-Pack ODS-AQ. При проведении твердофазной экстракции использовали шейкер BIOSAN MSV-3500, термостат BIOSAN CH-100 с функцией нагрева и охлаждения (—10...100°С), систему для пробоподготовки Waters с мембранным насосом KNF LaboPort и систему для выпаривания Zymark TurboVap LV (Calliper).
Приготовление стандартных растворов. Стандартный раствор ЦСП готовили растворением точной навески 2 мг в 2 мл воды и хранили при +4°С в течение 1 месяца. Рабочие растворы ЦСП готовили последовательным разбавлением водой ежедневно.
Пробоподготовка. К 500 мкл плазмы крови, содержащей ЦСП, добавляли 500 мкл 5%-го раствора ДДТК в 0.2 М NaOH и выдерживали при 45°С в течение 50 мин. Реакционную смесь, разбавленную вдвое водой, пропускали через патрон для твер-
дофазной экстракции Oasis HLB, предварительно кондиционированный 1 мл метанола и 1 мл воды, промывали 1 мл воды и 1 мл смеси (50 : 50 по объему) вода—метанол и элюировали комплекс [Р1(ДДТК)3]+ 500 мкл 2%-го раствора уксусной кислоты в ацетонитриле. Элюат выпаривали в токе азота при 35°С, сухой остаток растворяли в 500 мкл ацетонитрила.
При построении градуировочных зависимостей проводили аналогичную пробоподготовку для образцов плазмы крови с добавкой стандартного водного раствора ЦСП с известной концентрацией.
Условия определения. На основании серии предварительных экспериментов выбрана оптимальная подвижная фаза состава ацетонитрил — 15 мМ аммонийно-ацетатный буферный раствор с рН 4 (85 : 15 по объему); скорость потока подвижной фазы 0.25 мл/мин; объем вводимой пробы 20 мкл. Оптимизированы условия электрораспылительной ионизации: напряжение на капилляре 2200 В, давление распыляющего газа 2.7 бар, скорость потока и температура осушающего газа 10 л/мин и 300°С соответственно. Хрома-торгаммы записывали в режиме регистрации выбранного иона по значениию m/z 639.2, соответствующего комплексу платины с ДДТК.
Селективность определяли путем анализа холостых образцов биологической матрицы из 6 разных источников. Критерием селективности методики служило отсутствие мешающих веществ в 90% холостых проб.
Степень извлечения аналита из биологической матрицы определяли как отношение откликов детектора, полученных при анализе образцов плазмы крови с добавкой ЦСП, и водных растворов ЦСП той же концентрации. Степень извлечения оценивали в процентах для трех уровней концентраций - 10; 200; 400 нг/мл.
Концентрацию аналита, которую удавалось отличить от фонового шума с относительным стандартным отклонением менее 0.2 и достоверностью 80-120%, принимали за нижний предел количественного определения сн [17].
Относительные стандартные отклонения оценивали, выполняя 5 определений для каждого из трех уровней концентраций. Согласно критериям [17] относительное стандартное отклонение не должно превышать 0.15 для диапазона определяемых концентраций:
s = S
где s =
'(X - x)2 + (x2 - x)2 +... + (x„ - x)2
n -1
Для оценки достоверности проводили по 5 измерений для 3-х модельных растворов ЦСП в плазме крови (10; 200; 400 нг/мл) и устанавливали близость средних результатов анализа к истинно-
x
172
ЯРОШЕНКО и др.
T х 1000000
3.25 3.00 2.75 2.50 2.25 2.00 1.75 1.60 1.25 1.00 0.75 0.60 0.25
639.9(1)
638.9(1)
637.9(1)
.636.9(3),
_I_I_L_
640.9(1) 641.9(1)
II_I_I_I_и
И_I_I_I_Ulli
642.9
I
m/z
Рис. 1. Экспериментальное распределение изотопов в комплексе [Р1(ЦЦТК)3]+.
му значению концентрации аналита. Критерии достоверности: 85—115% (на нижнем пределе обнаружения 80-120%) [17].
Для построения градуировочной зависимости использовали 6 уровней концентраций в диапазоне 10-400 нг/мл (по 5 измерений для каждого уровня). Коэффициент корреляции составил 0.995.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Описанный метод определения ЦСП в плазме крови основан на образовании комплекса платины и ЦЦТК. В большинстве литературных источников описано образование комплекса состава Р1(ДЦТК)2 [8, 15, 18], однако при оптимизации условий его получения нами установлено, что конечным продуктом реакции ЦСП с ЦЦТК является комплекс состава 1 : 3:
2PtCl2(NH3)2 + 6Na(DDTC) + + 2H2O + O2 ^ 2[Pt(DDTC)3]+ OH- +
+ 2NaOH + 4NH3 + 4NaCl.
Анализ пробы после получения производного с ЦЦТК показал, что ее масс-спектр содержит сигнал с m/z 638.9, соответствующий иону [Р1(ЦЦТК)3]+, и характерное изотопное распределение (рис. 1).
Подтверждение состава комплекса проведено на приборе Shimadzu. Ион с m/z 638.9 ([Р1(ЦЦТК)з]+) в режиме тандемной масс-спек-трометрии фрагментируется с образованием осколка с m/z 490.9, соответствующего фрагменту Р1(ЦЦТК)2 (рис. 2а). Спектр на рисунке 2б
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.