МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2003, том 37, № 5, с. 861-867
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ
УДК 577.11:612.01.46
ОПРЕДЕЛЕНИЕ УЧАСТКОВ СВЯЗЫВАНИЯ ГЛИЦИРРИЗИНОВОЙ КИСЛОТЫ МЕТОДОМ ФАГОВОГО ДИСПЛЕЯ
© 2003 г. Т. В. Ильина*, Н. В. Федшк, А. Г. Бачинский, О. Ю. Туманова, В. Н. Кувшинов,
А. А. Ильичев, А. Г. Покровский
Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Министерства здравоохранения Российской Федерации, Колъцово, Новосибирская обл., 630559
Поступила в редакцию 13.01.2003 г.
С помощью методов аффинной селекции и иммуноферментного анализа из фаговой пептидной клонотеки отобраны фаги, экспонирующие на своей поверхности пептиды, специфически взаимодействующие с глицирризиновой кислотой (ГК). Результаты сравнения аминокислотных последовательностей этих пептидов и белков человека из баз данных, проведенного с помощью программы SIM, выявили гомологию отобранных пептидов с тирозин-протеинкиназами, серин-треонин-проте-инкиназами, тирозинфосфатазами и некоторыми рецепторами. Результаты поиска гомологии с вирусными белками, проведенного с помощью программы BLAST, показали, что ГК имеет сродство ко многим поверхностным белкам таких известных вирусов человека, как ВИЧ-1, гепатит С и гер-песвирусы.
Ключевые слова: глицирризиновая кислота, сайты связывания, фаговый дисплей, гомология с белками человека и вирусов.
Исследования механизмов действия биологически активных компонентов растений в настоящее время приобретают все больший интерес. В качестве примеров можно упомянуть исследования стероидов, тритерпенов, флаваноидов, различных алкалоидов и др. [1]. В эту же группу веществ входит тритерпеновый гликозид - глицирризиновая кислота (ГК), наиболее ценный компонент корня солодки, известного с древности лекарственного растения (рис. 1).
ГК, как и некоторые ее производные, давно используют в медицинской практике. Известно, что ГК обладает противовирусной, противовоспалительной, иммуностимулирующей, антиаллергической, противоопухолевой и другими активностями [2, 3]. Особое внимание специалистов привлекла способность ГК подавлять репродукцию ДНК- и РНК-содержащих вирусов, в частности вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) [4]. Одним из предполагаемых механизмов действия ГК является ингибирование протеинкиназной активности [5]. Из литературных данных известны некоторые белки-мишени для действия ГК. Это в основном субстраты для казеинкиназы 2 (СК-П) -лактоферрин, липоксигеназа и некоторые другие
Принятые сокращения: ГК - глицирризиновая кислота, ИФА - иммуноферментный анализ, ВИЧ-1 - вирус иммунодефицита человека 1-го типа, БСА - бычий сывороточный альбумин, СК-11 - казеинкиназа 2, а.о. - аминокислотные остатки.
* Эл. почта: tilina@ngs.ru
[6, 7]. Показано, что рекомбинантная обратная транскриптаза ВИЧ-1 является эффективным рецептором для рекомбинантной СК-11 человека и для нормальной активности обратной транскрип-тазы необходимо ее фосфорилирование [8]. ГК, как ингибитор СК-11, в высоких концентрациях (100 мкМ) полностью ингибирует фосфорилирование обратной транскриптазы и в этом может заключатся ее противовирусный эффект [5].
Знание механизмов действия ГК должно облегчить создание новых лекарственных препаратов на основе ГК и ее производных, а также максимально снизить вероятность побочных действий. В последнее время широкое применение находит технология фагового дисплея, которая позволяет идентифицировать антигенные детерминанты белков и пептидные лиганды различных рецепторов [9]. С помощью аффинной селекции можно отобрать бактериофаги, экспонирующие в составе одного из поверхностных белков различные аминокислотные последовательности. Последующее изучение первичной структуры ДНК в области встроек отобранных фагов позволяет определить аминокислотный состав пептидов, ответственных за связывание с молекулой, использованной в качестве мишени при проведении аффинной селекции.
Целью нашего исследования являлось выявление возможных белков-мишеней для ГК в клетке с использованием технологии фагового дисплея. Для решения этой задачи проводили селекцию
Me
COOH
Me
HOOC O
HO HOOC
HO
OH
Рис. 1. Глицирризиновая кислота.
связывающихся с ГК бактериофагов из фаговых клонотек fuse5-15mer и f88-4/15, определение и сравнение аминокислотных последовательностей отобранных пептидов с различными белками из банков данных SWISS-PROT, TrEMBL и BLAST.
УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА
Фаговый дисплей. В работе использовали штамм Escherichia coli К91Кан и фаговые пептидные клонотеки fuse5-15mer и f88-4/15, любезно предоставленные Дж. Смитом (Университет Миссури, Колумбия, США) [9]. Фаговые пептидные клонотеки содержали всевозможные пептиды длиной 15 а.о., которые были экспонированы на поверхности бактериофагов в составе минорного белка оболочки pIII (клонотека fuse5-15mer) и основного белка оболочки pVIII (f88-4/15). Наработку индивидуальных клонов, титрование фагов проводили по схеме, описанной Смитом [10].
Препарат ГК со степенью чистоты 98% был предоставлен Институтом органической химии СО РАН.
Синтез конъюгатов ГК с бычьим сывороточным альбумином (БСА) проводили согласно [11]. Соотношение молекул БСА и ГК в конъюгате составило 1 :11.
Аффинная селекция. Отбор фаговых клонов, экспонирующих на своей поверхности пептиды, специфически взаимодействующих с ГК, осуществляли из клонотеки f88-4/15 с биотинилирован-ным конъюгатом ГК с БСА по руководству [12]. Проводили четыре раунда селекции.
Селекцию пептидов из клонотеки fuse5-15mer и конъюгата ГК-БСА проводили в соответствии со схемой, описанной в работе [13]. Проводили
два раунда аффинной селекции без амплификации между раундами. После каждого раунда селекции получали фаговые колонии, которые использовали для наработки одноцепочечной ДНК и фагов для ИФА.
Специфичность связывания определяли методом конкурентного ИФА. Сорбцию фагов осуществляли на 96-луночных планшетах в концентрации 1010 вирионов/мл в Трис-солевом буфере. Затем добавляли конъюгат ГК-БСА, меченный биотином, в разведении 1 : 500. Параллельно проводили реакцию в присутствии 100-кратного избытка ГК. Наличие конкуренции выявляли с помощью конъюгата стрептавидина с пероксидазой в разведении 1 : 1000. Положительными считали пробы, значения оптической плотности (OD600) которых в опыте без добавления избытка ГК превышали значения оптической плотности в опыте с добавлением 100-кратного избытка ГК не менее, чем в 2 раза.
Определение нуклеотидных последовательностей фаговых ДНК в области вставки рандомизированных олигонуклеотидов проводили с использованием Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing Kit ("Amersham"). В работе использовали прайме-ры 5'-TGAATTTTCTGTATGAGG и 5'-AGTAGCA-GAAGCCTGAAGA [12].
Сравнение аминокислотных последовательностей вставок с белками человека и вирусов. Для
сравнения использовали последовательности всех белков человека (14823 последовательности), хранящиеся в банке SWISS-PROT (rl. 38) и TrEMBL (rl. 12) на сервере Европейского Института биоинформатики (ftp://ftp.ebi.ac.uk). Сравнение проводили с помощью программы SIM [14]. Несколько программ подготовки данных и анализа результатов были специально написаны на языке Perl в теоретическом отделе Института молекулярной биологии ГНЦ ВБ "Вектор". Сравнение аминокислотных последовательностей отобранных пептидов с белками вирусов человека проводили с использованием программы BLAST (ht-tp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Характеристика отобранных фаговых клонов
В результате проведенной аффинной селекции отобрано 29 фаговых клонов, связывающихся с ГК. Как показали результаты конкурентного ИФА, все фаги, кроме клонов 203 и 316, связывались с конъюгатом ГК-БСА (рис. 2). В качестве контролей использовали фаги дикого типа (не несущие вставок). Сравнение результатов параллельных опытов, проведенных с добавлением 100-кратного избытка ГК и без ее добавления, указывает на специфичность связывания отобранных фагов с ГК.
Результаты ИФА
Q
О
ь т с o н т o л п
w
а к с е ч и т п
О
1.5 1.0
0.5 0
ннннннннн ooooooooo ллллллллл
ооююю О ^
ккккккккк
0 0 0 1 0 0
К К К К К K'NtNtNtNmmmm-^-^'ä
ооооооккккккккк кя
ЧЧЧЧЧЧОООООООО"
кккккк
лллллллл кккккккк
o л к
es m
кк
кк
I I Разность значений ОБ двух экспериментов -■— Связывание с конъюгатом ГК-БСА
- ^ - Связывание с конъюгатом в присутствии 100-кратного избытка ГК Рис. 2. Взаимодействие клонов с конъюгатом ГК-БСА.
Изучение пеpвичнoй стpуктуpы 27 пептидoв, экспoниpoвaнныx на пoвеpxнoсти oтoбpaнныx фaгoв, не выявилo наличия стадных между ними aминoкислoтныx пoследoвaтельнoстей.
Пpи этoм oбщей для пептидoв зaкoнoмеpнoс-тью èbrno пoвышеннoе сoдеpжaние гидpoфoбныx a.o. (Phe, Ile, Leu, Met, Pro, Val, Tyr, Trp; суммapнaя чaстoтa встpечaемoсти гидpoфoбныx aминoкис-лoт в белках - 37.0%, сpеди исследуемых пепти-дoв - 49.2%). Coдеpжaние тpиптoфaнa пpевысилo сpеднее значение бoлее чем в 3 paзa. Kpoме тoгo, для мнoгиx пoследoвaтельнoстей пептидoв блoку гидpoфoбныx a.o. пpедшествoвaлa пoлoжительнo зapяженнaя aминoкислoтa (His, Lys или Arg), а инoгдa oни замыкали блoк гидpoфoбныx a.o.
Поиск гомологии отобранных пептидов с белками человека
Для поиска возможных мишеней действия ГК проводили сравнение аминокислотных последовательностей пептидов, аффинных к ГК, со всеми белками человека и вирусов человека, содержащимися в банках данных. Затем отбирали случаи, когда совпадающими оказывались не менее пяти а.о. пептида и фрагмента белка.
При анализе сходства аминокислотных последовательностей отобранных пептидов с белками из баз данных принимались во внимание только те случаи, когда не менее двух пептидов обнаруживали сходство с одним и тем же или группой
сходных по функциям белков; в противном случае считали, что совпадение случайно. Сходство пептидов с трансмембранными сегментами белков и сигнальными пептидами не принимали во внимание (исключая случаи гомологии с пептидами, образующими трансмембранные каналы).
Поскольку количество отобранных белков было велико, то может показаться, что ГК имеет сродство практически ко всем классам белков. Однако при отсутствии заметной гомологии между аминокисло
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.