ш
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2014, том 40, № 6, с. 752-757
УДК 577.152.34.05
ОПТИМИЗАЦИЯ ЭКСПРЕССИИ СУБТИЛИЗИНОПОДОБНОЙ ПРОТЕИНАЗЫ BACILLUS PUMILUS © 2014 г. А. М. Черёмин#, Ч. Нямсурен, А. А. Тойменцева, М. Р. Шарипова
Казанский (Приволжский) Федеральный Университет, 420008, Казань, ул. Кремлевская, 18 Поступила в редакцию 05.05.2014 г. Принята к печати 20.05.2014 г.
Изучены особенности экспрессии субтилизиноподобной протеиназы Bacilluspumilus. В регулятор-ной области гена фермента идентифицированы потенциальные сайты связывания с транскрипционным фактором DegU~P, которые оптимизировали для взаимодействия с этим регуляторным белком. Исследовали экспрессию модифицированного гена внеклеточной субтилизиноподобной протеиназы. Модификация одного из сайтов приводила к повышению экспрессии протеиназы в 2 раза. Сделано заключение, что оптимизация промотора привела к повышению уровня экспрессии субти-лизиноподобной протеиназы.
Ключевые слова: субтилизиноподобная протеиназа, Bacillus pumilus, оптимизация экспрессии.
DOI: 10.7868/S0132342314060050
ВВЕДЕНИЕ
Сериновые протеиназы, обнаруженные у всех живых организмов, представляют интерес для понимания физиологии микробной клетки, а также находят практическое применение. Участие этих белков в патологических состояниях, протеолизе, процессах дифференцировки и регуляции делает их незаменимыми для решения многих проблем современной биологии и медицины. Сериновые протеиназы выполняют важную роль в споруля-ции, метаболизме, клеточной сигнализации, росте клетки, формировании защитного ответа [1]. В процессе эволюции у микроорганизмов выработались механизмы адаптации к различным воздействиям окружающей среды. В основе формирования специфических ответов лежит механизм сигнальной трансдукции [2]. При истощении питательной среды, бактерии синтезируют ферменты деградации, среди которых большую часть составляют сериновые протеиназы. Синтез таких ферментов контролирует двухкомпонентная система трансдукции сигнала DegS-DegU [3].
Сокращения: DTT — дитиотреитол; EMSA — electrophoretic mobility shift assay; FAM — 6-флуоресцеина фосфорамидит; IPTG — изопропил-Р-.0-1тиогалактопиранозид; NPG — ор-то-нитрофенил-Р-галактозид. SDS — додецилсульфат натрия; SLS-протеаза — субтилизиноподобная сериновая протеиназа (subtilisin-like serine protease); ПААГ — полиа-криламидный гель; ПЦР — полимеразная цепная реакция. #Автор для связи (тел.: +7(927)409-38-16; эл. почта: andrey4eremin@mail.ru, marsharipova@gmail.com).
Бактерии Bacillus pumilus секретируют в среду внеклеточные протеиназы, среди которых доминирует сериновая субтилизиноподобная протеиназа (Subtilisin-like serine protease — SLS-протеи-наза), кодируемая геном aprBp (до 70% от общего количества внеклеточных протеиназ) [4]. Белок выделен и очищен из культуральной жидкости, изучены основные свойства фермента [5, 6]. Для тестирования биологических эффектов бактериального фермента возникла необходимость повышения уровня экспрессии белка с неизмененной структурой, в связи с чем, проблему повышения экспрессии SLS-протеиназы решали за счет оптимизации промоторной области гена.
Целью работы явилось повышение экспрессии SLS-протеиназы B. pumilus с неизмененной первичной структурой.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Для увеличения экспрессии SLS-протеиназы проводили поиск регуляторных сайтов в промотор-ной области гена этого фермента (AN AY754946.2), в частности, идентифицировали потенциальные участки взаимодействия промотора с фактором транскрипции — фосфорилированным белком DegU~P. С помощью пакета программ Vector NTI (Life Technologies, США) в промоторной области гена идентифицировали два фрагмента, имеющие 71% гомологии с консенсусной последовательностью GNCATTTAnnGNCATTTA, специ-
GAATGGAAGGTCCTTGATTACAACGTGGTCAGCCATTTAACTCAATCCTCCCCTTCTTAA AG ААС CTG TTATTG ТААС AG GTTCTTTTTAAAT Cj АС АААААС АААААААТА^ТАТТТТТТ ТАТАТ С G АААТТС G AAATAG ATG CTAG ACgTTTcTAc С t ATTTtAA G G CtTT Тс G G G t ATcgA^ TAT TTG ТСС G AAAAT G G AT С ATAAG AAAAAAAG С AC ACTTC CTTTTTAATAG ATAA CCGCTGAAACAGCAGAACAAACATATTTTCCCAACGTTTCCAAGTGACTTAATTCCCCAA TTTTC G CTAG G ACTTTC AC AAAAATTCG G GT CTACTCTTATT TGCCTACTTCCCT TAAAC
-35 -10 TG AATATAC AG AATAATC AAAC G AAT С ATTC TTATAG AC TAC G AAT G AT TATTCT G A AAT
RBS aprBp
AAGAAAAAAGGGATGTGGATTGTGCGTGAAAAAG
•-GNCA—TAi i ;GNCA"TTA-3'
DegU~P консенусная последовательность [7].
Рис. 1. Промоторная область гена 8Ь8-протеиназы. Потенциальные сайты связывания с фосфорилированным регуляторным белком DegU~P выделены затененной рамкой и пронумерованы "1" и "2". Нуклеотиды, не гомологичные консенсусу, выделены строчными буквами. -35-, -10- и RBS-сайты подчеркнуты. Старт-кодон выделен. Внизу в затененной рамке показана консенсусная последовательность белка DegU~P
фически взаимодействующей с регуляторным белком DegU~P [7] (рис. 1).
Для подтверждения in vivo данных информационного анализа, выясняли возможность ДНК-белкового взаимодействия между белком-регулятором DegU~P и промоторной областью гена суб-тилизиноподобной протеиназы методом задержки в геле (EMSA-анализ) [8]. Для этого амплифи-цировали промоторную область гена SLS-про-теиназы B. pumilus и выделили белок-регулятор DegU~P из рекомбинантного штамма E. coli, ха-
1 2
Рис. 2. SDS-ПААГ-электрофорез очищенного регу-ляторного белка DegU на колонке с №-№ГА. Белковые маркеры молекулярных масс (1); очищенный белок DegU (2).
рактеризующегося повышенной экспрессией этого фактора транскрипции. Белок DegU подвергали очистке методом аффинной хроматографии на Ni-NTA-сефарозе. Гомогенность белка мы устанавливали электрофорезом в 12.5% ПААГ, который показал наличие одного полипептида с молекулярной массой 26 кДа, соответствующей молекулярной массе белка DegU [9] (рис. 2). Впоследствии очищенный белок DegU фосфорили-ровали ATP в системе in vitro.
После проведения EMSA-анализа получили данные (рис. 3), которые свидетельствуют об образовании ДНК-белковых комплексов при смешивании очищенного белка DegU ~ P и ампли-фиката промотора гена aprBp (дорожки 3, 4 и 5). Наблюдаемое связывание белка с ДНК было специфичным, т.к. каждая реакционная смесь содер-
1 2 3 4 5
Рис. 3. БМ^А-анализ взаимодействия между промотором гена SLS протеиназы и регуляторным белком DegU~Р: свободная ДНК (1); ДНК с добавлением 50 (2), 100 (3); 200 (4); и 1000 нг фосфорилированного белка DegU~P (5).
754
ЧЕРЁМИН и др.
©
©
А
ПЦР-1
А
X АВ
ПЦР-2
<4
Б
СБ
Б
Конечный продукт
Рис. 4. Схема модификации промотора гена 8Ь8-про-теиназы с помощью двухстадийной ПЦР (подробности в тексте).
ы Я и н
и
д
Е
Рис. 5. Участок вектора рАС6 с геном lacZ, сайтами рестрикции для вставки промотора (полилинкер) и терминаторной областью гена.
0.20 0.18 0.16 0.14 0.12 0.10 0.08 0.06
0.04 0.02 0
I \Jc3L
1 2 3 4 5 6 7 Часы роста
8 9 10
жала дополнительно двукратное количество неспецифической эукариотической ДНК по отношению к исследуемой. Это позволило сделать заключение о влиянии этого регуляторного белка на экспрессию 8Ь8-протеиназы В. рытИт.
Для увеличения экспрессии фермента мы модифицировали идентифицированные сайты взаимодействия гена аргВр с белком регулятором Бе§и~Р до полной идентичности с консенсусной последовательностью III АппО^А IIIА (уровень гомологии 100%).
Изменения в ДНК вносили методом двухстадийной ПЦР (рис. 4). Мутации вводили в частично комплементарные друг другу праймеры В и С. Первые реакции осуществляли с двух пар прай-меров А + В и С + Б, полученные амплификаты АВ и СБ очищали и использовали в качестве матрицы для постановки второй реакции амплификации. Вторую реакцию проводили с использованием концевых праймеров А + Б. Промоторы с неизмененной последовательностью получали одностадийной ПЦР с использованием прайме-ров А + Б. В итоге по этой схеме мы получили три варианта промоторной области ДНК гена 8Ь8-протеиназы В. рытНыз — контрольный исходный промотор, промотор с измененным первым сайтом взаимодействия с фактором транскрипции и промотор с измененным вторым сайтом взаимодействия с Бе§и~Р в гене 8Ь8-протеиназы В. рытНыз.
Рис. 6. Р-Галактозидазная активность рекомбинант-ных штаммов В. 8ыЫПш 168. Штамм ВлыЬйШ 168 с неизмененной промоторной областью гена 8Ь8-протеи-назы (1); рекомбинантный штамм с модифицированным первым (2) и вторым сайтом (3) промотора аргВр для связывания с фосфорилированным DegU~P.
Все три фрагмента промоторной ДНК клонировали в плазмидный бинарный вектор рАС6 [10] (рис. 5), пригодный для трансформации в бациллы. Выбор вектора обоснован содержанием в нем в качестве репортерного белка гена lacZ с сайтом для гетерологичной вставки различных промотор-ных конструкций для изучения экспрессии под их управлением. В результате нами были получены три рекомбинантные векторные молекулы, различающиеся по структуре сайтов взаимодействия с фос-форилированным белком DegU~P: рАМ4 (контрольный промотор), рАМ41 (промотор с измененным первым сайтом) и рАМ42 (промотор с измененным вторым сайтом). Различия этих векторов по способности к экспрессии определяли по уровню экспрессии ими репортерного белка Р-га-лактозидазы. Присутствие модификаций в промоторе было подтверждено секвенированием.
На следующем этапе рекомбинантные векторы трансформировали в бактерии В. зыЬИШ 168 и определяли Р-галактозидазную активность ре-комбинантных штаммов (рис. 6). При сравнительном изучении гетерологичной экспрессии репортерного белка установили, что Р-галактози-
дазная активность в среде у всех рекомбинантных штаммов, появлялась на 6-м часу роста. Максимальная активность фермента достигалась через 8 ч роста культуры. На этом этапе сравнительный анализ активности репортерного белка, экспрессия которого происходила под контролем промотора с измененным вторым сайтом, оказалась выше в 2 раза активности репортерного белка, синтезированного под управлением контрольного промотора. Изменение другого сайта не приводило к повышению активности. По-видимому, регу-ляторный белок DegU~P при взаимодействии с промоторной областью гена SLS-протеиназы связывается только с одним из идентифицированных нами сайтов.
Таким образом, в ре
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.