СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ БИОПОЛИМЕРОВ И ИХ КОМПЛЕКСОВ
УДК 577.322.53;531.395
Ускоренная публикация
ОПТИМИЗАЦИЯ МЕТОДА РАСЧЕТА СТРУКТУРЫ ПЕПТИДОВ В РАСТВОРЕ ПО ДАННЫМ СПЕКТРОСКОПИИ ЯМР
© 2010 г. А. Н. Истрате1, А. Б. Манцызов1, С. А. Козин2, 3, В. И. Польшаков4*
Химический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Москва, 119991 2Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича Российской академии
медицинских наук, Москва, 119121 3Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук, Москва, 119991 4Центр магнитной томографии и спектроскопии факультета фундаментальной медицины Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Москва,119991 Поступила в редакцию и принята к печати 29.06.2010 г.
Представлена академиком А. А. Макаровым
Спектроскопия ЯМР получила признание в качестве метода определения структуры белков в растворе. Однако определение конформации небольших пептидов, претерпевающих быстрые молекулярные движения, остается сложной задачей. В значительной степени это обусловлено невозможностью определения из спектров ЯМР требуемого количества ограничений на межъядерные расстояния и диэдральные углы. Вместе с тем, короткие заряженные пептиды играют важную роль в ряде биологических процессов, в частности, в патогенезе нейродегенеративных заболеваний, включая болезнь Альцгеймера. В этой связи актуальна разработка метода расчета структуры небольших пептидов в водном окружении с использованием наиболее реалистичных силовых полей. Такой алгоритм разработан на базе силового поля AMBER-03 и пакета молекулярной динамики Gromacs после модификации его программного кода. Алгоритм расчета проверен на модельном пептиде, для которого известна структура в растворе, и на металлсвязывающем фрагменте в-амилоида крысы, структура которого определена альтернативными методами расчета на основании собственных экспериментальных данных. Разработанный алгоритм позволяет существенно повысить качество структур, в частности, улучшить статистику карты Рамачандрана и уменьшить среднеквадратичное отклонение координат атомов внутри семейства конформеров. Описанный протокол может быть использован при расчете структуры коротких пептидов, а также для оптимизации структуры более крупных белков, содержащих неструктурированные фрагменты.
Ключевые слова: спектроскопия ЯМР, молекулярная динамика, структура пептидов, бета-амилоид, болезнь Альцгеймера.
OPTIMIZATION OF THE METHODS FOR SMALL PEPTIDE SOLUTION STRUCTURE DETERMINATION BY NMR SPECTROSCOPY, by A. N. Istrate1, A. B. Mantsyzov1, S. A. Kozin2'3, V. I. Polshakov4* (1Chemical Department, Moscow State University, Moscow, 119991 Russia: 2Research Institute for Biomedical Chemistry, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow, 119121 Russia; 3Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences, Moscow, 119991 Russia; 4Center for Magnetic Tomography and Spectroscopy, Department of Fundamental Medicine, Moscow State University, Moscow, 119991 Russia; *e-mail: vpolsha@mail.ru). NMR spectroscopy was recognized as a method of protein structure determination in solution. However, determination of the conformation of small peptides, which undergo fast molecular motions, remains a challenge. This is mainly caused by impossibility to collect required quantity of the distance and dihedral angle restraints from NMR spectra. At the same time, short charged peptides play an important role in a number of biological processes, in particular in pathogenesis of neurodegenerative diseases including Alzheimer's disease. Therefore development of a method for structure calculation of small peptides in a water environment using the most realistic force fields seems to be of current importance. Such algorithm has been developed using the Amber-03 force field and software package Gromacs after updating its program code. The algorithm of calculation has been verified on a model peptide for which the solution structure is known, and on the metal binding fragment of rat в-amyloid for which structure has been determined by alternative methods. The developed algorithm substantially increases quality of structures, in particular RamachandTan plot statistics, and decreases RMSD of coordinates of atoms inside calculated family. The described protocol of calculation can be used for determination of conformation of short peptides, and also for structure optimization of larger proteins containing poorly structured fragments.
Keywords: NMR spectroscopy, molecular dynamics, peptide structure, в-amyloid, Alzheimer disease.
Принятые сокращения. АР — бета-амилоид болезни Альцгеймера; RatAP(i_i6) — N-концевой металлсвязывающий фрагмент Р-амило-ида крысы; DQF-COSY — корелляционная спектроскопия с двухквантовой фильтрацией когерентности; TOCSY — двумерная корреляционная спектроскопия с эстафетной передачей намагниченности по спиновой системе; NOESY — двумерная спектроскопия на базе детектирования ЯЭО; ЯЭО — ядерный эффект Оверхаузера; HSQC — гетероядерная корреляционная спектроскопия с однокван-товым переносом когерентности; AMBER — используемое для расчета структуры биомолекул силовое поле, описывающее валентные и невалентные взаимодействия атомов; СКО — среднее квадратичное отклонение; а.о. — аминокислотный остаток.
* Эл. почта: vpolsha@mail.ru
1075
9*
Многие нейродегенеративные заболевания, такие как болезни Альцгеймера, Паркинсона и заболевания прионной природы, связаны с процессами агрегации сравнительно небольших полипептидов [1, 2]. Установление структурных деталей процессов, определяющих переход от непатогенных растворимых пептидов к устойчивым к протеолизу белковым агрегатам, представляет несомненный интерес как для понимания молекулярного механизма развития заболеваний данного вида, так и для разработки методов их профилактики и лечения. В возникновении и развитии болезни Альцгеймера ключевая роль принадлежит бета-амилоиду (Ар) [3, 4], состоящему из 39—43 аминокислот и образующемуся при действии специфических протеаз из трансмембранного белка — предшественника [5, 6]. Ар — нормальный компонент биологических жидкостей (кровь, спинномозговая жидкость), где присутствует в сравнительно низких концентрациях (около 5—20 нМ), которые приблизительно одинаковы и для больных и для здоровых людей [7, 8]. Согласно широко принятой амилоидной гипотезе, ключевым молекулярным событием, приводящим к возникновению БА, является конформационное превращение растворимого мономерного Ар вначале в нейротоксичные димерные и олигомерные формы, а затем и в нерастворимые фибриллярные полимерные агрегаты, которые при дальнейшим их накоплении формируют амилоидные бляшки [9].
Пространственная структура модельных фибрилл Ар недавно установлена методом ЯМР твердого тела [10—12]. В частности, показано, что два разных участка молекулы Ар играют существенно различающиеся роли в структуре фибрилл. Более крупный C-концевой фрагмент (с 18 по 40—42 а.о.) образует р-лист, состоящий из двух антипараллельных тяжей, формирующих гиброфобную р-листо-вую структуру при взаимодействии р-слоев соседних молекул. N-концевой фрагмент Ар (с 1 по 17 а.о.) расположен на поверхности полимерного агрегата и не участвует в образовании гидрофобного ядра фибриллы. Тем не менее, отсутствие этого фрагмента полностью блокирует фибриллогенез in vivo, что указывает на его ключевую роль в процессах формирования амилоидных бляшек. Ранее установлено, что N-концевой (а.о. 1—16) фрагмент Ар является металлсвязывающим доменом [13—16], с которым связываются ионы цинка и некоторых других металлов [17, 18]. Следует отметить, что амилоидные бляшки действительно характеризуются повышенным содержанием двухвалентных металлов, в частности, цинка (до 1 мМ) [19]. В недавнем теоретическом исследовании [20] показано, что конформация N-концевого металлсвязывающего домена и возможность межмолекулярной координации ионов цинка — движущие силы процессов агрегации Ар человека. Ар обнаружен у всех млекопитающих, однако, интересно отметить тот факт, что у крыс отсутствуют процессы его агрегации [21], хотя аминокис-
лотные последовательности пептида человека и крысы различаются всего тремя заменами, причем именно в металлсвязывающем домене. Очевидно, что установление структуры металлсвязывающего домена Ар крысы актуально для определения молекулярной природы возникновения болезни Альц-геймера.
Ввиду невозможности получить монокристаллы Ар и их комплексов с ионами металлов, единственным методом получения структурной информации об исследуемых объектах является спектроскопия ЯМР. Определение структуры глобулярных белков методом ЯМР — сложная, но сравнительно хорошо решаемая задача [22]. При расчете структуры белка используют методы поиска минимума энергии молекулярной системы, основанные на молекулярной динамике и алгоритме "моделированного отжига" [23]. При этом для расчета используют силовые поля, не учитывающие электростатические взаимодействия, во всяком случае, на этапах молекулярной динамики при высокой температуре. Это обусловлено тем, что энергия электростатических взаимодействий часто приводит к нестабильности системы в процессе расчета. Более сложная задача — определение структуры небольших, конформационно подвижных пептидов. В этом случае число экспериментально определенных ограничений на межатомные расстояния и диэдральные углы обычно сравнительно невелико, и для получения надежных структурных данных в расчете необходимо учитывать электростатические взаимодействия между заряженными группами пептида.
В арсенале экспериментаторов имеется ряд программных пакетов для расчета структур биомолекул по данным ЯМР. Программные пакеты CNS и X-PLOR/NIH [24, 25] широко используются для расчета структур без использования потенциала электростатических взаимодействий. Модификация программы CNS с модулем ARIA для автоматического отнесения сигналов ядерного эффекта Оверхаузера (ЯОЭ) [26—28] предполагает совместное использование двух методов: расчет структуры биомолекулы в вакууме с помощью
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.