БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 1995, том 21, № 3, с. 179 - 187
УДК 577.112.6:542.953
ОПТИМИЗАЦИЯ ПРОТОКОЛА ТВЕРДОФАЗНОГО
АВТОМАТИЧЕСКОГО СИНТЕЗА ПЕПТИДОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПРОТОЧНОГО РЕАКТОРА ПЕРЕМЕННОГО ОБЪЕМА
© 1995 г. С. А. Мошпиков, Л. Г. Мустаева, А. В. Данилов, И. Е. Сухов*, М. Б. Бару
Филиал Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и ЮЛ. Овчинникова РАН, Пущино; * Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и ЮЛ. Овчинникова РАН, Москва
Поступила в редакцию 16.03.94 г.
Разработан протокол твердофазного синтеза пептидов в автоматических синтезаторах МШЮеп/ВювеагсЬ 9500 и 9600 со встроенными проточными реакторами переменного объема. Для оптимизации параметров процесса использовались данные свеллографического мониторинга. На модернизированных синтезаторах по разработанному протоколу синтезированы пептиды, содержащие от 10 до 21 аминокислотных остатков. Продемонстрирована значительная экономия используемых в синтезе растворителей и реагентов при удовлетворительном качестве синтезированных пептидов.
Ключевые слова: пептидный синтез; проточный реактор переменного объема; свеллографичес-кий мониторинг.
Автоматические синтезаторы в настоящее время широко применяются для получения пептидов твердофазным методом. Подавляющее большинство этих приборов ориентировано на работу с набухающими полистиролдивинилбен-зольными матрицами. Вследствие постоянного и часто значительного изменения объема пепти-дил-полимера в том или ином растворителе/реагенте на различных стадиях процесса синтеза обычно используют непроточные реакторы периодического действия с рабочим объемом, в несколько раз превышающим объем полимерной матрицы [1 - 7]. На практике протокол синтетического цикла есть не что иное, как многократные промывки полимерного носителя каким-ли-бо растворителем/реагентом, взятым в большом избытке.
Для работы с набухающими полимерными матрицами нами был предложен ПРПО [8], уже получивший применение в ТФСП [9 - 12]. ПРПО
Используемые сокращения: ПРПО - проточный реактор переменного объема, ТФСП - твердофазный синтез пептидов, Аст - ацетоамидометил, Вое - трет-бутилоксикарбонил, C1Z - 2-хлорбензилоксикарбонил, DIC - N.N'-диизопропил-карбодиимид, DMF - диметилформамид, Fmoc - 9-флуоре-нилметилоксикарбонил, HOBt - 1-гидроксибензотриазол, Mtr - 4-метокси-2,3,6-триметилбензилсульфонил, Pfp -пентафторфенил, TFA - трифторуксусная кислота, Tos -и-толуолсульфонил, Trt - трифенилметил.
Адрес для переписки: 142292, Пущино Московской обл., микрорайон Д, 5-22, Бару Михаилу Борисовичу.
оснащен системой измерения относительных объемов полимерного носителя в ходе синтеза (свеллографический мониторинг) [9], который облегчает оптимизацию протокола ТФСП с целью повышения его экономичности. Очевидно, что максимального эффекта такая оптимизация может достичь в автоматических системах для ТФСП. С этой целью мы осуществили структурную перестройку серийных автоматических синтезаторов MilliGen/Biosearch 9500 и 9600. Данные модели - достаточно удобный вариант для модернизации, так как в отличие от приборов фирм Applied Biosystems [2 - 3] и Biotronic [5] каждый клапан представляет собой отдельное независимо управляемое устройство. Кроме того, имеющееся программное обеспечение синтезатора позволяет легко изменять его или создавать новые программы управления синтезом.
Модернизация синтезаторов
MilliGen/Biosearch 9500 и 9600
Основная идея модернизации заключалась в замене собственного реактора периодического действия синтезатора MilliGen/Biosearch на ПРПО (использование ПРПО в модели 9500 освободило реактор синтезатора для использования его в качестве преактиватора по образу модели 9600). На рис. 1 и 2 изображены модифицированные гидравлические схемы синтезаторов MilliGen/Biosearch 9500 и 9600. Для обеспечения
179
2*
23
15
16
17
18
19 20
21
о о о о о о е-
34 35 36
ее^оее
10 11 12 13 14
-О О О О О-7
37 38 39
28 29 30 31 32 33
еооооо
Рис, 1. Общая гидравлическая схема модернизированного синтезатора МШЮеп/ВювеагсЬ 9500 со встроенным проточным реактором переменного объема, 1 - ПРПО; 2 - пептидил-полимер; 3 - преактивационный сосуд; 4, 5 - линии к сливным коллекторам; 6 - линия связи преактиватора с атмосферой; 7 - вход от источника газа; 8 - подающий мемб-ранно-плунжерный насос; 9 - дозирующий насос; 10 - 12 - клапаны резервуаров активирующих реагентов' 13 - клапан резервуара с промывочным растворителем; 14, 21 - клапаны продувки газом жидкостных магистралей; 15 - 20 - клапаны резервуаров растворителей и реагентов; 22 - клапан выбора сливного коллектора; 23 - 25 - клапаны организации рециркуляции потока во время реакции конденсации; 26 - клапан организации перемешивания газом растворов реагентов в преактиваторе; 27 - клапан спязи преактиватора с атмосферой; 28 - 39 - клапаны аминокислотных резервуаров. Стрелка указывает на возвратно-поступательное движение подвижного адаптера в реакторе.
проточного режима работы ПРПО (1), возможности параллельных процессов промывок пепти-дил-полимера (2) и активации аминокислотного производного в преактиваторе (3) гидравлическая схема содержит три основных контура:
- линию резервуаров растворителей и реагентов (15 - 20), подключенную через дополнительно установленный нами насос (8) с приводом серийного насоса ММС (Чехия) со смонтированной на нем специальной мембранно-плунжерной головкой, подсоединенную к ПРПО (1);
- линию активирующих реагентов (10 - 12) и растворителя (33) для промывки коммуникаций преактиватора через линию аминокислотных резервуаров (28 - 39 для модели 9500 и 28 - 47 для модели 9600), проходящую через ограничивающий дозирующий насос (9) и подсоединенную к преактиватору (3);
- систему клапанов (23 - 25) (для обеих моделей и дополнительный клапан (53) для модели 9600), обеспечивающую режим рециркуляции раствора реагента из преактиватора (3) через ПРПО (1).
В ходе других операций синтетического цикла (не проходящих в режиме рециркуляции потока) прошедший через ПРПО растворитель/реагент через клапаны (22, 23) направляется в общий или дополнительный (для сильных кислот/оснований) коллектор слива - линии (4) и (5) соответственно.
Слив у клапана (25) сохранен для автономной промывки преактиватора (3) перед следующей конденсацией. В модели 9600, кроме того, были сохранены сливные клапаны (50, 51) (для возможности автономной промывки линий резервуаров) и направляющие клапаны (48,49) (для выбора одной из линий аминокислотных резервуаров).
Газовые схемы претерпели незначительные изменения: все растворители/реагенты и аминокислотные производные хранятся под давлением инертного газа от источника (7), что обеспечивает защиту реактивов от атмосферных водяных паров и кислорода и подачу реагентов через ограничивающий насос (9). Для работы мембранно-плунжерного насоса (8) давление не обязательно: фактически подача растворителей/реагентов в ПРПО (1) производится не давлением газа, как
УТЛ22 23
21
20
19
18
17
16
15
52 53
о о о о -о о о
* 51 8 24
Ч _N \ \ N N
14 13 12 11 10
Г5^
28 29 30 31 32 33 34 35 36 37
оооооооооо
38 39 40 41 42 43 44 45 46 47
ОООООООООО
V V V
V V V V
Рис. 2. Общая гидравлическая схема модернизированного синтезатора МЛЮеп/ВюзеагсЬ 9600 со встроенным проточным реактором переменного объема. Позиции 1 - 27 и стрелка - см. подпись к рис. 1; 28 - 47 - клапаны аминокислотных резервуаров; 48,49 - клапаны выбора линии аминокислотных резервуаров; 50 - 52 -сливные клапаны; 53 - клапан организации рециркуляции потока по время реакции конденсации.
в исходных конструкциях синтезаторов, а насосом (8). Кроме того, газ используется для перемешивания реагентов в ходе преактивации (через клапан 26) и продувки линий растворителей/реагентов (через клапаны (14) и (21)). В модели 9600 был сохранен газовый клапан (52) для обеспечения быстрого слива жидкости из преактиватора (3). Клапан (27), запирающий линию выхода в атмосферу (б), обеспечивает избыточное давление в преактиваторе (3) во время операций слива жидкости.
В модели 9500 в линию подачи газа в аминокислотные резервуары был встроен клапан сброса давления (аналогично модели 9600), что позволило сделать автоматическими операции растворения/активации аминокислотных производных непосредственно в резервуарах.
Сенсорные датчики переполнения и опорожнения реактора были использованы для контроля уровня жидкости в преактиваторе (3). Датчики давления газа были сохранены без изменений.
Разработка протокола синтеза
Использование в серийных синтезаторах ГТРПО потребовало разработки нового протокола синтеза. За основу был взят ранее предложен-
ный контрастный протокол ТФСП [10]. Принципиальным отличием такого протокола является схема промежуточных отмывок пептидил-поли-мера в синтетическом цикле. В исходном неконтрастном протоколе используют многократные последовательные промывки набухшего полимерного носителя одним и тем же растворителем, причем даже смена растворителя СРМР на СН2С1? или наоборот) приводит к незначительному изменению объема. Использованный нами протокол включает в себя чередующиеся промывки пепти-дил-полимера растворителями, одни из которых его сжимают (например, смесь /ВцСЩФМР), а другие переводят в набухшее состояние (РМР или СН2С12).
При этом мы исходили из предположения, что в процессе сжатия пептидил-полимера происходит вытеснение растворителя/реагента из гранул полимера. При следующей операции набухания происходит интенсивное поглощение пептидил-полимером чистого растворителя и, следовательно, разбавление оставшегося. Параллельно с этим процессом происходит постоянный диффузионный обмен между внутригранульной жидкой фазой и непрерывно поступающим извне растворителем, В совокупности оба процесса (разбавление
при сжатии/набухании и диффузионный обмен) приводят к более эффективному удалению остаточного реагента и, в конечном итоге, к сокращению количеств растворителей, необходимых для отмывки пептидил-полимера.
Кроме того, использование при контрастном протоколе свеллографического мониторинга позволяет точно определять моменты завершения операций набухания/сжатия. И при наличии обратно
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.