УДК 577.171.4
ОПТИМИЗАЦИЯ ПРОЦЕДУРЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО АНАЛИЗА ОКСИДА АЗОТА ДЛЯ ЕГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ В СРЕДЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК МЛЕКОПИТАЮЩИХ
© 2015 г. М. Г. Акимов#, Е. В. Фомина-Агеева, В. В. Безуглов
ФГБУНИнститут биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997ГСП, Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 Поступила в редакцию 21.01.2013 г. Принята к печати 06.05.2014 г.
Оптимизирована процедура определения оксида азота в виде нитрит-иона, пригодная для количественного анализа его продуцирования культурой клеток млекопитающих. Установлено, что оптимальные результаты дает метод Гриса, адаптированный для микрообъемов, после предварительной процедуры восстановления N03, образовавшегося в среде анализа из нитрит-иона, до определяемого N 02 с помощью неактивированного кадмия. Метод верифицирован на культуре клеток крысиной глиомы С6. Разработанный метод пригоден для определения оксида азота в 96- и 48-луночных культуральных планшетах; предел детектирования составляет 2.1 ± 0.1 мкМ для N О- и 2.9 ± 0.1 мкМ для N О-.
Ключевые слова: оксид азота, нитрат, нитрит, кадмий, сульфат гидразина, метод Гриса.
БОТ: 10.7868/80132342315010029
ВВЕДЕНИЕ
Оксид азота (N0) является многофункциональной молекулой: он участвует в нейротранс-миссии, вазодилатации, является цитостатиче-ским и цитотоксическим агентом [1]. Помимо прочего, он выделяется макрофагами, астроцита-ми и микроглией в ответ на провоспалительные сигналы [2, 3] и, следовательно, может быть использован в качестве маркера воспалительного ответа в ходе скрининга про- и противовоспалительных агентов.
В настоящее время разработаны четыре принципиальных подхода к определению уровня генерации N0: определение активности N0-синтазы в гомогенатах тканей или клеток с использованием изотопно-меченного аргинина [4], прямое детектирование выделяющегося оксида азота с помощью специального электрода [5], измерение флуоресценции продукта реакции флуоресцеина с N0 [6] или определение концентрации продукта его неферментативного окисления — нитрит-иона (метод Гриса) [7]. Основным недостатком флуориметрического метода является необходи-
Сокращения: N£0 — дигидрохлорид Л^-нафтилэтиленди-амина, 8Л — сульфаниламид. #Автор для связи (тел.: +7 (495) 330-65-92; эл. почта: akimovmike@yandex.ru).
мость использования специального оборудования (флуориметр, а для скрининговых исследований — планшентный флуоресцентный ридер и специальные культуральные планшеты). Прямое определение активности N0-синтазы подразумевает использование соединений, меченных радиоизотопами, и, как и электродный метод, не подходит для скрининга.
При работе с культурами клеток, представляющими собой удобную модель для первичного скрининга, возникает дополнительная проблема: скорость образования N0 в них мала (для глиомы не более 60 нмоль/мг за 24 ч [8]), и потому для накопления достаточного количества N0 требуется длительная инкубация (24—48 ч) и, возможно, концентрирование культуральной среды. В этих условиях в результате реакции с водой N0 полностью превращается в нитрит-анион и, следовательно, не может быть напрямую детектирован с помощью электрода.
Метод Гриса — образование окрашенного комплекса N О— с нафтилэтилендиамином (N£0) и сульфаниламидом (8Л) [7] — является, таким образом, наиболее удобной альтернативой определения N0, но и он не лишен недостатков. Замораживание препарата, требующееся в тех случаях, когда проведение анализа должно быть отложено
во времени, а также влияние некоторых компонентов культуральной среды могут приводить к
окислению NO- до NO- [5, 9], который с NED и SA уже не реагирует. Для преодоления данного препятствия предложено дополнить метод Гриса
предварительным восстановлением N O- до
NO-с помощью бактериальных нитратредуктаз
[10], кадмия или катионов ванадия V3+ в виде соответствующих солей [10, 11], либо сульфата гидразина [12]. Указанные нитратредуктазы достаточно дороги и потому плохо подходят для скри-нинговых исследований. Методы восстановления нитрата с помощью сульфата гидразина и кадмия или ванадия были разработаны для больших объемов (от десятков миллилитров до литров) исследуемых растворов (элюаты колоночной хроматографии, сточные воды) и не пригодны для работы с культурами клеток млекопитающих, где объем аналита может не превышать 0.1 мл.
Целью данной работы была оптимизация процедуры количественного анализа оксида азота на основе метода Гриса в культуральной среде после индукции экспрессии NO-синтазы в культуре клеток провоспалительными агентами.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Оптимизация метода определения нитрита
Поскольку поставленная задача подразумевала, что концентрация нитрита, образовавшегося из NO, который выделяется при инкубации клеток в водной среде, в образце будет весьма малой, в качестве первого шага был модифицирован исходный метод Гриса [7] (метод Н1) с целью повышения чувствительности. Прежде всего, согласно рекомендации авторов [17], SA растворили не в 5% H3PO4, а в 3 М HCl и уменьшили в 5 раз конечную концентрацию NED. В дополнение к этому мы увеличили соотношение образец—реактив с 1 : 1 до 3 : 1 (75 мкл анализируемого раствора на 25 мкл смеси реагентов), повысив концентрацию SA и NED в реактиве в 2 раза (метод Н2). При этом чувствительность метода повысилась в 2.2 раза (рис. 1, кривая 2), а предел обнаружения, соответственно, снизился с 4.4 ± 0.4 до 2.3 ± 0.1 мкМ. Дополнительно нами был предложен вариант метода с раздельным добавлением реагентов по схеме: добавление SA, инкубация 10 мин при комнатной температуре, добавление NED, инкубация 10 мин при комнатной температуре [19] (метод Н3); такое разделение дало возможность дополнительно снизить предел обнаружения до 2.1 ± 0.1 мкМ.
Поскольку предполагалось, что за время индукции NO-синтазы в клетках (24 ч) часть нитрита обязательно превратится в нитрат, было решено адаптировать для условий работы с клеточны-
A540, О. E. 0.3 г
0 5 10 15 20 25
[NaNO2], мкМ
Рис. 1. Концентрационная зависимость оптического поглощения реакционной смеси реакции Гриса при разной предварительной обработке образцов. 1 — без обработки, исходный метод Гриса (метод Н1), 2 — без обработки, оптимизированный метод Гриса (метод Н2), 3 — без обработки, оптимизированный метод Гриса с раздельным добавлением SA и NED (метод Н3), 4 — предварительное восстановление нитрата сульфатом гидразина по оптимизированному методу + оптимизированный метод Гриса (метод Г4 + Н3), 5 — предварительное восстановление нитрата неактивированным кадмием по оптимизированному методу + + оптимизированный метод Гриса (метод К4 + Н3); (среднее ± стандартное отклонение).
ми культурами один из методов восстановления нитрата до нитрита. Первыми в качестве восстанавливающего агента был испытаны соли гидразина как более пригодные для стандартизации и скрининга (восстановитель добавляется в виде раствора, а не в виде твердого вещества, как в случае кадмия).
Оптимизация метода восстановления нитрата сульфатом гидразина
При изучении восстановления нитрата солями гидразина за основу был взят ранее предложенный метод (Бауэр, Холм-Хансен [12]), в котором к 100 мкл исследуемого раствора прибавляют 200 мкл 60 г/л раствора циклогексиламинопро-пансульфоновой кислоты (CAPS), pH 10, 100 мкл восстанавливающей смеси (56.6 мМ хлорид гидразина и 0.63 мМ CuSO4 • 5H2O), выдерживают 8 мин при 33°С, охлаждают 5 мин при комнатной температуре и добавляют 200 мкл ацетона (метод Г1). Однако, оказалось, что предел определения NO- с помощью этой методики крайне высок — 42 ± 11 мкМ (рис. 2).
С целью повышения чувствительности рассматриваемого метода мы проверили влияние на результат определения NO противоиона гидрази-
A540, О. E 0.15
0.10
0.05
40 60 [NaNO3], мкМ
Рис. 2. Концентрационная зависимость оптического поглощения реакционной смеси оптимизированной реакции Гриса при восстановлении нитрата гидразином разными методами. 1 — исходная методика (метод Г1 + Н3), 2 — замена гидразинхлорида гидразин-сульфатом (метод Г2 + Н3), 3 — объем буфера снижен в 4 раза (метод Г3 + Н3), 4 — финальный вариант методики (метод Г4 + Н3); (среднее ± стандартное отклонение).
A540, О. E 0.06
0.04 -
0.02 -
0 20 40
Время, мин
Рис. 3. Зависимость оптического поглощения реакционной смеси оптимизированной реакции Гриса (метод Н3) в образцах после предварительного восстановления нитрата сульфатом гидразина (метод Г2) от длительности восстановления. Концентрации нитрата 100 (1), 50 (2), 25 мкМ (3); (среднее ± ± стандартное отклонение).
на, продолжительности восстановления, объема буфера и ацетона, а также концентрации гидразина и сульфата меди.
Замена хлорида гидразина на сульфат (метод Г2) не влияла на предел измерения (р = 0.3065 в ковариационном анализе).
Согласно исходной методике (Г1), восстановление нитрата заканчивается за 8 мин, однако, мы
обнаружили, что оптическое поглощение в последующей реакции Гриса достигает стационарного значения только после 18 мин предварительной инкубации с восстановителем (рис. 3). Следовательно, во избежание повышенной вариабельности результатов, восстановление следует проводить как минимум 18 мин; это время было использовано при дальнейшей оптимизации метода.
Уменьшение объема реакционной среды за счет снижения в 4 раза объема буферного раствора и в 8 раз объема ацетона (метод Г3) привело к снижению предела измерения до 22 ± 2 мкМ (рис. 2).
При сравнении продуктов реакции Гриса для стандарта NaNO3, восстановленного с помощью сульфата гидразина (Г3), и для разбавленного во столько же раз водой стандарта NaNO2 было отмечено, что в последнем случае оптическое поглощение достоверно выше в 6 раз (p > 0.05 в тесте Стьюдента). Мы предположили, что данный эффект может быть следствием побочных реакций соли гидразина или сульфата меди с компонентами реакции Гриса. В эксперименте с имитацией восстановления стандарта NaNO2 по методу Г3 было зафиксировано ожидаемое снижение эффективности реакции Гриса, что подтвердило нашу гипотезу. С целью преодоления обнаруженного снижения эффективности проверили влияние концентраций сульфата гидразина и с
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.