научная статья по теме ОРТОЛОГИ ГЕНА АРАБИДОПСИСА CLAVATA1 У КУЛЬТУРНЫХ ФОРМ ВRASSIСAСEAE Биология

Текст научной статьи на тему «ОРТОЛОГИ ГЕНА АРАБИДОПСИСА CLAVATA1 У КУЛЬТУРНЫХ ФОРМ ВRASSIСAСEAE»

ОНТОГЕНЕЗ, 2004, том 35, № 1, с. 41-46

ГЕНЕТИКА РАЗВИТИЯ

УДК 575.143+575.15+575.17+581.143

ОРТОЛОГИ ГЕНА АРАБИДОПСИСА CLAVATA1 У КУЛЬТУРНЫХ

ФОРМ Brassieaeeae1

© 2004 г. В. В. Мартынов, И. Л. Цветков, Э. Е. Хавкин

Институт сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН 127550 Москва, ул. Тимирязевская, д. 42

Поступила в редакцию 19.05.03 г. Окончательный вариант получен 25.08.03 г.

Ген арабидопсиса CLAVATA1 (CLV1) необходим для поддержания постоянного соотношения между стволовыми клетками в центральной зоне апикальной меристемы побега и детерминированными клетками на ее периферии. У других представителей Brassicaceae ген CLV1 ранее не исследовали. Методом прямой амплификации геномной ДНК мы получили полноразмерный ортолог CLV1 из рапса (Brassica napus), а также три фрагмента CLV1 из сурепицы (B. rapa), рапса (B. napus) и рыжика посевного (Camelina sativa), которые соответствуют трансмембранному домену и части киназного домена белка CLAVATA1. Нуклеотидные и производные аминокислотные последовательности полноразмерного ортолога из B. napus и гена-прототипа из арабидопсиса сходны на 81 и 87% соответственно, а в случае коротких фрагментов сходство с геном-прототипом достигает 91-93 и 98% соответственно. По своему строению ген CLV1 у Brassicaceae существенно отличается от предполагаемых структурных гомологов CLV1 за пределами этого семейства.

Ключевые слова: Arabidopsis, Brassica, Camelina, CLAVATA1, апикальная меристема побега, стволовые клетки, развитие растений, рецептороподобные киназы.

Среди процессов, управляющих ростом и формообразованием растений, важное место принадлежит регуляции устойчивого функционирования апикальной меристемы стебля. К настоящему времени хорошо изучены гены регуляторного контура, который поддерживает постоянное соотношение между стволовыми клетками в центральной зоне апикальной меристемы побега и клетками на ее периферии, уже вступившими на путь детерминации, идентификации и дифферен-цировки тканей листа и стебля (Clark, 2001; DeY-oung, Clark, 2001; Haecker, Laux, 2001; Sharma, Fletcher, 2002). В этом контуре (рис. 1) важная роль принадлежит генам CLAVATA1-CLAVATA3 и WUSCHEL. Среди них подробнее других исследован ген CLAVATA1 (CLV1) арабидопсиса (Clark et al., 1993, 1997; Dievart et al., 2003), который принадлежит к обширному семейству генов рецеп-торных протеинкиназ. Продукт CLV1, белок CLAVATA1, состоит из трех доменов (рис. 2): внеклеточного LRR, содержащего богатые лейцином повторы, трансмембранного и внутриклеточного киназного. Сходный с CLV1 план строения мы находим у нескольких других рецепторных киназ, регулирующих ключевые процессы развития растений и их устойчивость к патогенам.

1 Работа частично поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (проект < 01-04-48202).

Исследования последних лет показали, что белок CLAVATA1 образует in vivo как минимум два белковых комплекса с молекулярной массой 185 и 450 кДа (DeYoung, Clark, 2001). Комплекс 185 кДа - это мультимер, образованный CLAVATA1 и CLAVATA2, другим рецепторным белком, который отличается от белка CLAVATA1 отсутствием киназного домена. Активный комплекс 450 кДа содержит белки CLAVATA1 и CLAVATA2 в качестве рецепторов, белок CLAVATA3 - в качестве лиганда, белок KAPP (kinase-associated protein phosphatase) - в качестве негативного регулятора активности киназного домена CLAVATA1 и белок Rho-GTFase. Роль последнего заключается в передаче сигнала от рецепторного комплекса на mApK (mitogen-activated protein kinase)-каскад и далее, еще через несколько неизвестных пока стадий, в ядро клетки, где он подавляет экспрессию гена WUSCHEL. Последний играет определяющую роль в поддержании постоянного числа стволовых клеток в центральной зоне апикальной меристемы, поэтому эту систему генов часто называют регуляторной петлей CLAVATA-WUSCHEL (Brand et al., 2000; Schoof et al., 2000). Экспрессия гена WUSCHEL начинается на ранних стадиях эмбриогенеза в апикальных субэпидермальных клетках, еще до возникновения апикальной меристемы. По мере развития меристемы домен экспрессии гена WUSCHEL постепенно сужается, и к

Рис. 1. Регуляторный контур генов, принимающих участие в поддержании апикальной меристемы, и локализация их экспрессии (по: Sharma, Fletcher, 2002).

L1-L3 - слои апикальной меристемы, CLV1-CLV3 - гены CLAVATA1-CLAVATA3, WUS - ген WUSCHEL.

моменту окончательного формирования апикальной меристемы (стадия торпедовидного зародыша) этот домен ограничен небольшим числом клеток в слое L3 центральной зоны апикальной меристемы. Экспрессия гена CLV1 начинается на стадии сердцевидного зародыша и становится более заметной в слоях L2 и L3 на стадии торпедовидного зародыша; в слое L3 домены CLV1 и WUSCHEL перекрываются. Сходным образом в апикальной меристеме побега эти два гена экспрессируются в разных слоях, и продукты этих генов взаимодействуют между собой описанным выше образом (Sharma, Fletcher, 2002).

Мутации арабидопсиса по гену CLV1 приводят к накоплению в центре меристемы недифференцированных клеток: в результате сокращается длина междоузлий, а на характерном фасцииро-ванном побеге и соцветии увеличивается число листьев и прилистников, кроме того, увеличивается число органов в цветке, размер плодов и количество семян (Clark et al., 1993, 1997; Dievart et al., 2003). Подобные изменения в строении побегов, соцветий, цветков и плодов у культурных форм Brassicaceae могут быть хозяйственно ценными признаками и подвергаться интенсивному искусственному отбору, поэтому изучение генетического полиморфизма CLV1 у этих форм представляет особый интерес. Однако до настоящего времени такие исследования не проводились.

3 4

5' 3'

1 —* <— 3022

1 2

...............................N

1 980

Рис. 2. Схема строения белка CLAVATA1 и расположения праймеров 1-4 на гене относительно структурно-функциональных участков этого белка. Домены: ) - LRR, (В) - трансмембранный, (ШШ) -киназный; (□) - ДНК.

В настоящем сообщении описаны гомологи гена CLV1 арабидопсиса у трех культивируемых видов растений семейства Brassicaceae. Эти гомологи получены прямой амплификацией геномной ДНК и обнаруживают высокую степень сходства с геном-прототипом.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Геномную ДНК выделяли из зеленых листьев двухнедельных проростков рапса (Brassica napus L., № 0137787 и к5065 по каталогу Всероссийского института растениеводства, С.-Петербург), сурепицы (B. rapa L., к299) и рыжика посевного (Camelina sativa L., к4144) методом Сагаи Маруф (Sagai Maroof et al., 1994), модифицированным для свежего растительного материала. Для амплификации фрагмента ДНК, соответствующего участку 1872-2380 гена CLV1 арабидопсиса (GenBank accession № U96877), использовали праймеры:

1 - AGGACAAACCTCCGATCACAATCAC,

2 - CTCTATGTCTCGTCTCCCATTGAAG;

для амплификации фрагмента ДНК, соответствующего участку 1-2994 гена CLV1, использовали праймеры:

3 - ATGGCGATGAGACTTTTGAAGACTC,

4 - TTAGGAGGGTTAGTGAGCATGTGC

(см. рис. 2). Олигонуклеотиды синтезировали в фирме "Синтол" (Россия).

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в термоциклере Терцик ("ДНК-технологии", Россия). Реакционная смесь объемом 25 мкл содержала 50 нг геномной ДНК, 1 единицу Tag-полимеразы ("Fermentas", Литва), 2.5 мМ MgCl2, по 0.25 мМ каждого из четырех дезоксири-бонуклеозидтрифосфатов и по 10 пкмоль каждого из двух олигонуклеотидов. Протокол амплификации с праймерами 1 и 2 включал предварительную денатурацию ДНК при 94°С в течение 4 мин, 35 циклов по 45 с денатурации при 94°С, 45 с при 64°С и 40 с при 67°С для отжига праймеров с матрицей, 1 мин 20 с при 72°С для синтеза и завершающий синтез при 72°С в течение 5 мин.

В случае праймеров 3 и 4 отжиг праймеров с матрицей продолжался 45 с при 54°С. Для разделения продуктов амплификации использовали электрофорез в 1%-ном агарозном геле ("Chemapol", Чехия) в присутствии бромистого этидия. Визуализацию продуктов амплификации осуществляли при помощи трансиллюминатора УВТ1, оборудованного видеосистемой для регистрации гелей "гель-1-биоком" ("Компания Биоком", Россия). Длину амплифицированных фрагментов ДНК определяли с помощью маркера Gene Ruler 1kb DNA Ladder ("Fermentas", Литва). Специфические продукты амплификации, соответствующие по размеру целевому фрагменту CLV1 арабидопсиса, очищали от посторонних ПЦР-фрагментов методом препаративного электрофореза в агарозном геле и элюировали из агарозного геля согласно протоколу DIAtom™ DNA Prep 100 ("Компания Биоком").

ПЦР-фрагменты геномной ДНК рапса, сурепицы и рыжика лигировали в вектор pGEM-T в соответствии с инструкцией фирмы производителя ("Promega", США), полученные рекомбинант-ные плазмиды клонировали в клетках Escherichia coli штамма DH5a. Для отбора клонов, содержащих рекомбинантные плазмиды, использовали бело-голубую селекцию по протоколу фирмы производителя ("Promega"). Плазмидную ДНК из отобранных колоний выделяли методом щелочного лизиса. Для идентификации встроенного фрагмента гена проводили амплификацию плаз-мидной ДНК с указанными выше праймерами к гену CLV1.

Нуклеотидную последовательность фрагментов ДНК, клонированных в составе pGEM-T, определяли на автоматическом анализаторе ABI 310 Prism ("PE Biosystems", США) с прямого и обратного олигонуклеотидных праймеров ("Синтол"), подобранных к фланкирующим вставку участкам плазмиды pGEM-T (AATTGGGCCCGACGTC и C ATATGGTCG ACCTGC AGG). Производные аминокислотные последовательности были получены с помощью программы GENEPRO 4.20 ("Riverside Scientific", США). Для поиска ближайших гомологов использовали программы BLASTN 2.0.11 и BLASTP 2.0.12, доступные на сервере www.ncbi.nlm.nih.gov. Окончательное выравнивание проводили вручную. Для кластерного анализа использовали программу MEGALIGN ("DNASTAR", США).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Мы получили четыре фрагмента генома культурных растений семейства Brassicaceae, гомологичных гену CLV1 арабидопсиса: три частичных гомолога из рапса, сурепицы и рыжика (зарегистрированы в GenBank под № AY130760, AY130759 и AF467952 соответственно) и полноразмерный

гомолог из рапса (AY283519). Анализ первичной структуры этих фрагментов показал, чт

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком