УДК 578.233,577.322
ОСОБЕННОСТИ АДСОРБЦИИ МАТРИКСНОГО ВИРУСНОГО БЕЛКА М1
В КИСЛОЙ СРЕДЕ
© 2013 г. В. В. Бревнов1,2, Н. В. Федорова 3, А. В. Инденбом1*
Институт физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина РАН, 119071, Москва, Ленинский просп., 31, стр. 4; * электронная почта: a.indenbom@gmail.com 2Московский физико-технический институт (государственный университет), 141700, Московская область, Долгопрудный, Институтский пер., 9 3Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, 119992, Москва, Ленинские горы, 1, стр. 40
Поступила в редакцию 29.12.2012 г.
Методом рефрактометрии поверхностного плазмонного резонанса исследована адсорбция вирусного матриксного белка М1 на химически привитом к поверхности золота слое молекул карбокси-гексадекантиола, моделирующем поверхность клеточной мембраны. Показано, что в кислой среде (при рН 4.0) доля необратимо адсорбированного белка увеличивается со временем. В интервале концентраций от 50 до 500 нМ белок формирует на поверхности монослой. Обнаружено, что в этом диапазоне концентраций количество адсорбированного белка увеличивается более чем в 3 раза. Важной особенностью является то, что даже при самых малых концентрациях молекулы М1 полностью занимают всю поверхность подложки, и дополнительная его добавка не приводит к дальнейшей адсорбции. Для объяснения обнаруженных явлений сделано предположение, что в ходе адсорбции число связей между молекулой М1 и поверхностью увеличивается, приводя к ее распластыванию. По-видимому, этот эффект обусловлен слабоупорядоченной структурой С-домена белка. Высказана гипотеза о том, что распад белок-липидной оболочки вириона гриппа в кислой среде происходит не в результате десорбции М1, а обусловлен ослаблением межбелковых связей.
Ключевые слова: белок М1, адсорбция белков, вирус гриппа, поверхностный плазмонный резонанс.
Б01: 10.7868/80233475513030043
Белок М1 является наиболее широко представленным белком вируса гриппа [1, 2]. С одной стороны, он формирует каркас вирусной частицы, располагаясь под липидной оболочкой с внедренными в нее белками, а с другой, связан с расположенным внутри вириона рибонуклеопротеином (РНП) [3—5]. Склонность этого белка к олигоме-ризации в нейтральной среде [6] определяет высокую плотность белковой сети [7], которая не позволяет выйти из вириона достаточно крупным частицам РНП. Вирус гриппа проникает в инфицируемую клетку путем эндоцитоза. Кислотность среды внутри эндосомы в процессе ее движения к ядру клетки растет вплоть до рН 4 [3, 8]. При за-кислении среды М1 диссоциирует от РНП, позволяя ему войти в ядро клетки [3, 4, 9]. Механизм такого рН-индуцированного разрушения оболочки вируса до сих пор остается неясным.
Белок М1 представляет собой небольшую молекулу (27.8 кДа), состоящую из 252 аминокислотных остатков (а.о.). Его структура состоит из
трех доменов: N (2-67 а.о.), М (91-158 а.о.) и С (165-252 а.о). N и М-домены состоят из четырех а-спиралей: Н1-Н4, Н6-Н9 соответственно. Эти домены соединены короткой спиралью Н5, а Ми С-домены соединены петлей Ь9. При всех описанных [3, 10, 11] попытках кристаллизации белка наблюдалась его фрагментация в области петли Ь9, поэтому на данный момент достоверно установлена только структура NM-фрагмента. В кислой среде (при рН 4) он кристаллизуется в виде димеров с характерными размерами 3 х 4 х 6 нм. Структура С-концевой части (и, соответственно, молекулы М1 в целом) до сих пор не установлена. Согласно данным, полученным методами малоуглового нейтронного рассеяния, кругового дихроизма и электронной микроскопии [7, 11], мономер М1 имеет вытянутую структуру, хотя ^концевая часть белка имеет форму плотной глобулы. На слабоупорядоченную структуру С-концевой части указывают данные тритиевой планиграфии [12, 13]. В нейтральной среде белок
в целом заряжен положительно: 48 аминокислотных остатков несут положительный заряд, а 23 — отрицательный. В кислой среде суммарный положительный заряд белка существенно возрастает. Кроме того, в белке М1 присутствуют 127 гидрофобных аминокислот (аланин, глицин, изолей-цин, лейцин, фенилаланин, триптофан, валин, метионин, пролин и цистеин). Следовательно, в целом белок М1 можно рассматривать как амфи-фильную молекулу, которая может проявлять склонность как к электростатическим, так и к гидрофобным взаимодействиям с поверхностью.
На данный момент механизмы формирования и разрушения белок-липидной оболочки вирио-на гриппа остаются неясными. Разрушение каркаса может происходить как в результате десорбции М1, так и вследствие взаимного отталкивания белковых молекул с сохранением их связи с молекулами липидов. С целью определения того, какой из механизмов реализуется в природе, мы исследовали адсорбцию белка М1 в кислой среде на отрицательно заряженной подложке, моделирующей поверхность вирусной мембраны.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Реактивы. В экспериментах использовали следующие реактивы: KCl (х. ч. Реахим, Россия), MES (Calbiochem, США, чистота >99%), KOH (х. ч. Реахим, Россия), HCl (х. ч. Реахим, Россия), хлороформ (х. ч. Реахим, Россия), н-гексан (х. ч., Реахим, Россия), карбоксигексадекантиол (16-mer-captohexadecanoic acid, 99%, Aldrich, США). Все растворы готовили на бидистиллированной воде.
Приготовление белка М1. Матриксный белок М1 был получен из вирионов гриппа штамма A/PR/8/34 методом Жирнова [14]. При использовании этого метода М1 выделяли путем кислотной солюбилизации мембраны вируса гриппа неионным детергентом NP40 (Igepal СА-630) в MES-буфере (50 мМ 2^-морфолиноэтансуль-фоновая кислота, 100 мМ NaCl, рН 4.0).
Препараты с концентрацией белка 0.1—0.2 мг/мл диализовали против 20 мМ MES и Bio-Beads (SM-2 Adsorbent, Bio-Rad, США) в течение 18 ч при 4°С. Соотношение объемов растворов белка и буфера Vp : Vb составляло 1 : 400. На 200 мкг белка добавляли 700 мг Bio-Beads (предварительно обработанного метанолом). Диализованный препарат белка М1 концентрировали на мембранах Micro-con (Ultracel YM-10, Regenerated Cellulose 10000 MWCO, Millipore Corporation Bedford, США) при 10 000 об./мин в течение 2ч при 4°С до конечной концентрации 0.2—0.3 мг/мл. Чистоту полученных препаратов белка контролировали электрофорезом в присутствии додецилсульфата натрия (SDS) по методу Лэммли [15]. Электрофоретиче-
скии анализ проводили в невосстанавливающих условиях, используя 15% разделяющий и 6% концентрирующий полиакриламидный гель (ПААГ) (соотношение акриламид : ^№-метиленбиса-криламид = 33 : 1), в MiniPROTEAN 3 Cell (BioRad, США). Перед нанесением на гель образцы (5—10 мкл) смешивали с равным объемом лизиру-ющего буфера (62.5 мМ трис-HCl, pH 6.8; 2% SDS, 6 М мочевина, 20% глицерин, 0.02% бром-феноловый синий) и нагревали в течение 3 мин при 100°С. Гели окрашивали 0.22% Кумасси G-250 (Serva). Белок идентифицировали с помощью MALDI-масспектрометрии.
Метод рефрактометрии поверхностного плаз-монного резонанса (ППР). Адсорбцию белка изучали на ППР-рефрактометре "Biosuplar 6" (Mivitec, Германия). В этом приборе используется приз-менный метод возбуждения ПЭВ, основанный на геометрии Кречманна. К позолоченной поверхности чипа прикреплялась плоская (примерно 1 х х 0.5 х 0.1 см3) двухкамерная проточная ячейка. Через нее с помощью перистальтического насоса (MasterFlex C/L, Barland Co., США) по замкнутому кругу прокачивали растворы. Луч полупроводникового лазера через призму направлялся на сенсорный чип и далее попадал на фотодетектор. Характерная зависимость интенсивности отраженной волны от угла падения излучения на верхнюю грань призмы имеет вид кривой с четко выраженным минимумом, соответствующим условиям резонанса (рис. 1). В результате адсорбции происходит сдвиг резонансной кривой вправо. Кинетику адсорбции белка регистрировали путем записи роста интенсивности отраженной волны при фиксированном угле падения излучения, соответствующем левой части резонансной кривой с максимальным наклоном (см. рис. 1), полученной до момента введения белка. Таким образом, рост сигнала с высокой чувствительностью характеризовал сдвиг резонансной кривой при адсорбции.
Все измерения проводили при комнатной температуре (24 ± 1°C). Для учета небольших изменений температуры в качестве канала сравнения использовали сигнал ППР, полученный из второго отсека ячейки, заполненного буферным раствором, не содержащим белок. Часть контрольных экспериментов, проведенная в термостабилизиро-ванной ячейке при температуре 37°C, показала стабильность полученных образцов при этой температуре и сохранение всех основных закономерностей адсорбции М1. Однако расположение термостати-руемого блока непосредственно над исследуемой поверхностью не позволяло контролировать появление пузырьков воздуха в ячейке, искажающих результаты измерений. Поэтому при проведении длительных экспериментов (до 3 ч и более) с последовательными стадиями замены раствора использовали
Сигнал ППР, отн. ед.
Угол, град
Рис. 1. Сдвиг резонансной кривой при адсорбции (показан горизонтальной стрелкой). Кривая (1) — до адсорбции, кривая (2) — после. По вертикальной оси отложена интенсивность отраженной волны в условных единицах. По горизонтальной оси отложен угол падения излучения на подложку. Пунктирная линия соответствует углу, при котором по изменению (росту) интенсивности сигнала исследуют кинетику адсорбции.
нетермостатируемую ячейку с прозрачной верхней стенкой.
Приготовление тиолизированных подложек. Для
создания поверхности, моделирующей отрицательно заряженный липидный бислой оболочки вириона, к поверхности позолоченных стеклянных чипов для ППР-рефрактометра химически прививали молекулы карбоксигесадекантиола. Длина углеводородной цепи в такой молекуле близка к обычной длине углеводородного радикала молекул липидов. Концевые карбоксильные группы тиола обеспечивали слабый отрицательный заряд поверхности получаемых покрытий, подобно тому, как отрицательно заряженные группы липидов мембраны вириона создают ее заряд [7].
Перед тиолизированием поверхности позолоченные пластинки проходили несколько стадий очистки. Сначала и
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.