БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2013, том 30, № 1, с. 30-39
УДК 577.23
ОСОБЕННОСТИ АКТИВАЦИИ СВОБОДНОГО ОКИСЛЕНИЯ В МИТОХОНДРИЯХ ПЕЧЕНИ а,ш-ТЕТРАДЕКАНДИОЛОВОЙ КИСЛОТОЙ
© 2013 г. С. Р. Рыбакова, М. В. Дубинин, В. Н. Самарцев
Марийский государственный университет, 424001 Йошкар-Ола, пл. Ленина, 1;
факс: (836-2) 56-57-81; электронная почта: samvic56@mail.ru Поступила в редакцию 29.03.2012 г.
Установлено, что а,ю-тетрадекандиоловая кислота (ТДК) в концентрации 0—500 мкМ дозозависи-мо увеличивает (до 2 раз) скорость несопряженного с синтезом АТР дыхания (свободное окисление) митохондрий печени. Этот эффект ТДК наблюдается в присутствии избытка EGTA, что исключает индукцию Са2+-зависимой неспецифической проницаемости внутренней мембраны митохондрий (открытие поры). Циклоспорин А, добавленный к митохондриям в необычной для него высокой концентрации (10 мкМ), как до, так и после ТДК, полностью устраняет этот эффект. Действие ТДК в отличие от других активаторов свободного окисления — протонофорного разобщителя и-трифто-рометоксикарбонилцианидфенилгидразона и пальмитиновой кислоты, не сопровождается инги-бированием окислительного синтеза АТР и уменьшением коэффициента ADP/O. Показано, что ингибитор Н+-АТР-синтазы олигомицин, а также ADP, АТР и Pj не влияют на активность ТДК. Это свидетельствует о том, что эффект ТДК не связан с воздействием на Н+-АТР-синтазу и отличается от эффекта мембранотропных разобщителей. В присутствии липофильного катиона тетрафенил-фосфония (ТФФ+) циклоспорин А не влияет на стимулированное ТДК дыхание митохондрий, а карбоксиатрактилат и глутамат, добавленные после ТДК, ингибируют дыхание. Кроме того, в этих условиях ТДК снижает скорость окислительного синтеза АТР и уменьшает коэффициент ADP/O. Таким образом, в присутствии ТФФ+ влияние ТДК на митохондрии сходно с разобщающим действием монокарбоновых жирных кислот и, по-видимому, осуществляется при участии ADP/ATP- и аспартат/глутаматного антипортеров. Предполагается, что в отсутствие ТФФ+ свободное окисление в митохондриях печени ТДК активируется по механизму действия так называемых десопряга-ющих агентов и связано с переключением работы комплексов дыхательной цепи на холостой режим (внутреннее разобщение).
Ключевые слова: митохондрии, свободное окисление, а,ю-тетрадекандиоловая кислота, циклоспорин А.
DOI: 10.7868/S0233475512050155
В клетках печени от 20 до 30% потребления кислорода митохондриями не связано с синтезом АТР [1, 2]. Предполагается, что подобное так называемое свободное окисление может выполнять следующие функции: 1) участвовать в продукции тепла для поддержания температуры тела у теплокровных животных [3, 4]; 2) ингибировать продукцию активных форм кислорода в митохондриях [2, 3, 5, 6]; 3) увеличивать степень регулирования окислительного синтеза АТР [1]; 4) участвовать в нормализации обмена веществ при ожирении [7, 8] и в регуляции метаболизма углеводов [1, 9].
Одним из основных механизмов свободного окисления в митохондриях является пассивная утечка протонов через внутреннюю мембрану митохондрий [2—7]. Пассивная утечка протонов может быть усилена с помощью химических ве-
ществ, называемых протонофорными разобщителями окислительного фосфорилирования [3, 10]. Эти разобщители, увеличивая протонную проводимость внутренней мембраны митохондрий и рассеивая электрохимический потенциал, стимулируют дыхание и снижают эффективность окислительного синтеза АТР (уменьшают коэффициент ADP/O) [3, 10, 11]. Недавно были открыты новые разобщители окислительного фосфорили-рования — мембранотропные разобщители. В отличие от классических протонофорных разобщителей, взаимодействующих с протонами в объеме водной фазы, мембранотропные разобщители преимущественно взаимодействуют с фракцией протонов, связанных с внешней поверхностью внутренней мембраны митохондрий [12, 13]. Pj вызывает полное подавление стимуляции дыха-
ния мембранотропными разобщителями [12]. В настоящее время большое внимание уделяется поиску разобщителей, направленных на митохондрии, с целью возможного их использования в качестве потенциальных фармакологических средств [13—17].
Эффективными природными разобщителями окислительного фосфорилирования являются свободные жирные кислоты, уровень которых в клетках животных и человека повышается при различных физиологических и патологических состояниях [3, 7, 18]. Наиболее полно изучено разобщающее действие предельных монокарбо-новых жирных кислот. Установлено, что в митохондриях печени, инкубируемых в отсутствие ионов кальция, в разобщающем действии таких жирных кислот принимают участие белки-переносчики внутренней мембраны, осуществляющие обменный транспорт ADP на ATP (ADP/ATP-антипортер) и аспартата на глутамат (аспартат/глутаматный антипортер) [3, 18—20]. Участие этих белков в разобщающем действии жирных кислот заключается в переносе аниона жирной кислоты с внутреннего монослоя мембраны на наружный, где эти анионы протониру-ются и перемещаются в обратном направлении без участия белков по механизму флип-флоп, освобождая затем протон в матрикс [3, 19]. Специфический ингибитор ADP/ATP-антипортера карбоксиатрактилат и субстраты аспартат/глута-матного антипортера глутамат и аспартат подавляют разобщающее действие жирных кислот (ресо-прягающий эффект) [3, 19, 20]. Эти переносчики определяют до 70—80% разобщающей активности пальмитиновой и лауриновой кислот [20, 21]. Другая часть кальций-независимой разобщающей активности этих жирных кислот осуществляется по иному механизму с участием особой системы, чувствительной к циклоспорину А в высокой концентрации [21].
Пассивная утечка протонов через внутреннюю мембрану митохондрий не единственный механизм свободного окисления. Более 20 лет назад было обнаружено, что некоторые из общих и местных анестетиков, так называемых десопряга-ющих агентов (decouplers), способны стимулировать транспорт электронов по дыхательной цепи без снижения мембранного потенциала [22—24]. Предположили, что механизм этого процесса обусловлен переходом работы комплексов дыхательной цепи на холостой режим, т.е. на так называемое внутреннее разобщение [24, 25]. Согласно альтернативной точке зрения, стимуляция дыхания митохондрий без снижения мембранного потенциала, в частности одним из общих анестетиков хлороформом, может быть следствием нарушения целостности внутренней мембраны у части этих органелл [26]. В ранних работах было показано, что при некоторых экспериментальных
условиях (добавление валиномицина к митохондриям, инкубируемым в присутствии ионов натрия) монокарбоновые жирные кислоты также способны стимулировать дыхание без существенного снижения мембранного потенциала [27, 28]. Однако эта точка зрения не получила дальнейшего развития (более подробно смотри в обзоре [29]).
Пиродные метаболиты монокарбоновых жирных кислот — а,ю-диоловые (дикарбоновые) кислоты, образуются в клетках печени путем ©-окисления их монокарбоновых аналогов [30—32]. В норме доля этого пути метаболизма жирных кислот не превышает и 10%. При некоторых состояниях, сопровождающихся увеличением содержания свободных монокарбоновых жирных кислот, таких как ожирение, голодание, диабет, а также при различных нарушениях их метаболизма (главным образом р-окисления), путь ©-окисления значительно усиливается [31, 32].
Данные о влиянии длинноцепочечных а,©-диоловых кислот на энергетические функции изолированных митохондрий противоречивы. Так установлено, что а,©-тетрадекандиоловая кислота (ТДК) стимулирует дыхание митохондрий печени без снижения мембранного потенциала [33]. В этом случае ее действие сходно с действием описанных выше десопрягающих агентов. В других работах показано, что действие на митохондрии печени неметаболизируемого аналога длинноцепочечных а,©-диоловых кислот MEDICA16 приводит как к стимуляции дыхания, так и к снижению мембранного потенциала [34, 35]. Это противоречие, по-видимому, могло вызываться различными экспериментальными условиями [33—35]. Наряду с этим, неизученным остается влияние длинноцепочечных а,©-диоло-вых кислот на окислительный синтез АТР в митохондриях.
Цель настоящей работы — выяснение механизмов действия одной из длинноцепочечных а,©-диоловых кислот — ТДК, как активатора свободного окисления и регулятора окислительного синтеза АТР в митохондриях печени. Для достижения поставленной цели необходимо было выяснить: обратим ли процесс стимуляции дыхания ТДК, как действует эта дикарбоновая кислота на окислительный синтез АТР и при каких экспериментальных условиях меняется механизм ее действия. Особое внимание уделено сравнению эффектов ТДК с действием на митохондрии классического протонофорного разобщителя я-трифторометокси-карбонилцианидфенилгидразона (ФКФ), а также монокарбоновой пальмитиновой кислоты.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Опыты проводили на митохондриях, выделенных из печени белых половозрелых крыс массой
Мит
Рис. 1. Сравнение действия на дыхание митохондрий печени циклоспорина А при его добавлении до (а и в) и после (б и г) ТДК при температуре 25°C (а и б) и 37°C (в и г). Мит — митохондрии (1 мг/мл); ЦС — циклоспорин А, 10 мкМ; ТДК, 400 мкМ; ДНФ - 2,4-ди-нитрофенол, 50 мкМ. Цифры у кривых — скорость потребления кислорода, нмоль 02/мин на 1 мг белка. Здесь и на рис. 2—5 условия опыта и состав среды инкубации приведены в разделе "Материалы и методы".
210—250 г методом дифференциального центрифугирования с последующим освобождением от эндогенных жирных кислот с помощью бычьего сывороточного альбумина (БСА) [33]. Среда выделения содержала 250 мМ сахарозу, 1 мМ EGTA, 5 мМ HEPES (рН до 7.4 доведен трис(оксиме-тил)аминометаном). Концентрацию белка митохондрий определяли биуретовым методом, в качестве стандарта использовали раствор БСА. Дыхание митохондрий регистрировали полярографическим методом при температуре 25°C, в отдельных опытах — при 37°C (указано в подписи к рис. 1). Среда инкубации содержала 200 мМ сахарозу, 20 мМ KCl, 5 мМ янтарную кислоту, 0.5 мМ EGTA, 2 мМ
MgCl2, 10 мМ HEPES (рН до 7.4 доведен трис(ок-симетил)аминометаном), 2 мкМ ротенон. При необходимости в кислородную ячейку сразу после митохондрий добавля
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.