МИКРОБИОЛОГИЯ
УДК 579.222
ОСОБЕННОСТИ БИОСИНТЕЗА ВНЕКЛЕТОЧНОЙ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗЫ Proteus mirabilis
© 2015 г. Н. М. Замалютдинова*, М. Р. Шарипова*, Л. М. Богомольная**, Е. С. Божокина***, А. М. Марданова*
*Казанский федеральный университет, 420008 Казань, ул. Кремлевская, 18 **Техасский аграрный университет, Техас, США ***Институт цитологии РАН, 194064 Санкт-Петербург, Тихорецкий просп., 4 E-mail: mardanovaayslu@mail.ru Поступила в редакцию 12.05.2014 г.
Исследованы биосинтез металлопротеиназы штаммом Proteus mirabilis 5127-1 на разных средах и влияние на биосинтез глюкозы и мочевины. Отмечено, что бактерии P. mirabilis 5127-1 секретируют в среду металлопротеиназу в виде двух изоформ (52 и 50 кДа). Установлено, что синтез протеиназы полностью подавляется при росте бактерий на синтетических средах, а также в присутствии в среде LB глюкозы. Показано, что добавление в среду мочевины приводит к увеличению продуктивности культуры по синтезу протеиназы. Максимальная продуктивность культуры по синтезу протеиназы обнаружена на среде с натуральной мочой. При росте бактерий на искусственной моче протеиназа появлялась в среде только после 12 ч роста в виде одной изоформы.
DOI: 10.7868/S0002332915010142
Proteus mirabilis, условно-патогенная грамот-рицательная бактерия семейства Enterobacteri-aceae, — возбудитель оппортунистических и госпитальных инфекций, поражающих респираторный тракт, кожу, ожоговые поверхности и раны (Endimiani et al., 2005). Чаще всего P. mirabilis является причиной инфекций мочевыводящих путей, особенно при длительном использовании катетеров (Jakobsen et al., 2008). Один из факторов вирулентности этих бактерий — внеклеточная ме-таллопротеиназа (Senior et al., 1987). Установлена корреляция между способностями штамма к роению и к секреции протеиназ. Штаммы, не способные к роению, были протеолитически неактивны (Senior, 1999; Walker et al., 1999). Ген металлопротеиназы P. mirabilis (zapA) входит в состав оперона, включающего в себя гены, кодирующие АТФ-зависимую транспортную систему, которая обеспечивает перенос фермента из клеток в куль-туральную среду. Белок, кодируемый геном zapA, относится к семейству серрализинов (Wassif et al., 1995).
При изучении транскриптома роящихся клеток P. mirabilis показано, что экспрессия гена zapA увеличивается в роящихся клетках, особенно сильно на стадии консолидации (Pearson et al., 2010). В то же время исследование экспрессии генов P. mirabilis in vivo в процессе инфицирования мочевыводящих путей показало, что ген zapA экс-прессировался на базовом уровне или даже ниже. Предполагается, что либо экспрессия этого гена
может быть специфична к месту локализации бактерий в мочевых путях, либо незначительные изменения на уровне транскрипции могут приводить к значимым изменениям в активности (Pearson et al., 2011).
Цель работы — характеристика биосинтеза внеклеточной протеиназы штаммом P. mirabilis 5127-1 на разных средах и в зависимости от присутствия глюкозы и мочевины в среде культивирования. Штамм P. mirabilis 5127-1 был предоставлен Е.С. Божокиной (Институт цитологии РАН).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Бактерии культивировали при 37°C с интенсивностью качания 200 об./мин (вибростенд, Braun, Германия). Для культивирования бактерий использовали среду Лурия—Бертани (LB), синтетическую среду М9, синтетическую и натуральную мочу. Состав среды LB, %: триптон — 1, дрожжевой экстракт — 0.5, NaCl — 0.5, pH 8.5. Среда LBA содержала 2% агара (Sambrook et al., 1989). Мочевину в конечных концентрациях 4—600 мМ вносили в питательную среду перед посевом в виде стерильных растворов. Для изучения влияния глюкозы в среду LB вносили 1.5% глюкозы. Состав среды М9, г/л: Na2HPO4 - 6, KH2PO4 - 3, NaCl - 0.5, NH4Cl - 1. В среду М9 вносили глюкозу или глицерин в конечной концентрации 0.2%. Витамин В1 добавляли до конечной кон-
центрации 1 мг/мл. После автоклавирования на 1 л среды добавляли 1 мл 1 М раствора MgSO4 •
• 7H2O, 10 мл 0.01 М раствора CaCl2.
Состав искусственной мочи, г/л (Jones et al, 2007): пептон L37 — 1, дрожжевой экстракт — 0.05, молочная кислота — 0.1, лимонная кислота — 0.4, мочевина - 10, CaCl2 • 2H2O - 0.37, NaCl - 5.2, FeSO4 - 0.012, MgSO4 • 7H2O - 0.49, Na2SO4 •
• 10H20 - 3.2, KH2PO4 - 0.95, K2HPO4 - 1.2, NH4Cl - 1.3, H2O дистиллированная. В качестве натуральной мочи использовали детскую объединенную мочу, которую стерилизовали фильтрованием через мембранный фильтр с диаметром пор 0.2 мкм. Стерильность подтверждали высевом на среду LB. В качестве инокулята использовали 12-часовую культуру, выращенную на среде LB. Для определения казеинолитической активности использовали среду следующего состава, г/л: казеин -5, дрожжевой экстракт - 5, NaCl - 5, агар - 20.
Нуклеотидную последовательность гена 16S рРНК определяли и анализировали методом, описанным ранее (Janda, Abbott, 2007). Прирост биомассы измеряли нефелометрически на фотоэлек-трокалориметре КФК-2 при длине волны 590 нм. Биомассу выражали в единицах светопоглощения в кювете толщиной 1 см. Общее количество белка определяли методом Брэдфорд (Bradford, 1976). Биоинформационный анализ промоторной области гена zapA проводили с помощью базы данных ASAP (https://asap.ahabs.wisc.edu/ asap/home.php) и программы BPROM (www.softberry.com).
Протеолитическую активность в культураль-ной жидкости определяли по расщеплению казеина методом Каверзневой (Каверзнева, 1971). За единицу казеинолитической активности принимали количество фермента, которое приводило к освобождению 1 мкмоля тирозина за 1 мин. Азо-казеин расщепляли методом, описанным ранее (Wassif et al, 1995). За единицу активности принимали такое количество активности, которое приводит к увеличению оптической плотности на 0.1 единицы. Продуктивность культуры в отношении синтеза протеиназы определяли как отношение протеолитической активности в культу-ральной жидкости к биомассе и выражали в условных единицах. Супернатант культуральной жидкости получали центрифугированием культуры при 13000 об./мин в течение 15 мин.
В опытах по исследованию влияния ингибиторов в инкубационные смеси вносили в конечной концентрации 10 мМ орто--фенантролин и 2 мМ PMSF.
Электрофорез белков в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия проводили по стандартной методике (Laem-mli, 1970). Зимографию проб культуральной жид-
кости P. mirabilis в ПААГ с желатином (1 мг/мл) проводили методом, описанным ранее (Oliver et al., 1999). Для проведения количественного анализа гели сканировали и полученные изображения обрабатывали с помощью программы Quanti Scan 2.1.
Математическую обработку данных проводили с использованием программы Microsoft Excel путем расчета среднеквадратичного отклонения (а). Результаты считали достоверными при а < 15%. В качестве критерия достоверности получаемых разностей использовали критерий Стьюдента (P < < 0.05 — достоверный уровень значимости).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Филогенетическое положение штамма 5127-1 установили путем анализа последовательности гена 16S рРНК. Показано, что штамм 5127-1 относится к виду P. mirabilis. Сходство генов 16S рРНК штамма 5127-1 и P. mirabilis CIFRI Ch-TSB28 составило 98.9%. При росте бактерий штамма 5127-1 на агаризованной среде с казеином штамм проявлял способность к роению и образовывал зоны гидролиза, что свидетельствует о его про-теолитической активности.
Для исследования специфичности протеиназы штамма P. mirabilis 5127-1 использовали такие субстраты, как казеин, азоказеин и желатин. Показано, что данный микроорганизм способен разлагать азоказеин, желатин и казеин, причем казеин разлагается менее эффективно. Полученные результаты согласуются с данными литературы, согласно которым многие штаммы P. mirabilis более эффективно расщепляют желатин, чем казеин (Senior, 1999). В дальнейших опытах для определения протеолитической активности в культу-ральной жидкости использовали азоказеин, а для зимографии — желатин.
Динамику роста и биосинтеза внеклеточных протеиназ P. mirabilis изучали при культивировании на среде LB при 37°С. Стационарная фаза роста наступала через 11—12 ч культивирования. Протеиназы выделялись в среду после 5 ч роста бактерий и продолжали секретироваться на всех этапах развития культуры (рис. 1), достигнув максимума в стационарной фазе роста бактерий. Внеклеточная протеолитическая активность полностью подавлялась 10 мМ орто-фенантроли-ном, ингибитором металлопротеиназ, и была нечувствительной к 2 мМ PMSF, ингибитору сери-новых протеиназ. Таким образом, внеклеточная протеиназа P. mirabilis 5127-1 является металло-протеиназой.
Рост бактерий и биосинтез протеиназ исследовали на синтетической среде М9, которую моди-
Q
О
H о о
Р
0.6
q^'a ............ -iïN- ill—¿mi—u-L-l
4 8 12 16 20 24 Время, ч
ii
28 32
36
0.4
0.2
40
S $
о
о «
m S H
Рис. 1. Динамика роста (1) и внеклеточной протеолитической активности P. mirabilis по расщеплению азоказеина (2), а также протеолитическая активность в присутствии 10 мМ орто-фенантролина (3). OD590 нм — оптическая плотность культуры при 590 нм.
3
2
1
0
фицировали добавлением различных органических компонентов. К солевой основе с тиамином (1 мг/мл) добавляли глюкозу или глицерин в качестве источника углерода в конечной концентрации 0.2%. Было установлено, что на модифицированных синтетических средах М9 бактерии растут более чем в 2 раза медленнее, чем на среде LB (16 ч культивирования) (рис. 2). Во всех вариантах сред в следовых количествах обнаруживалась протеолитическая активность по отношению к азоказеину. Однако она составляла не более 2% активности фермента в культуральной жидкости бактерий, выращенных на среде LB.
Показано, что в культуральной жидкости разных штаммов P. mirabilis присутствуют две изо-формы металлопротеиназы (Senior, 1999; Pearson
1.6
s 1.2
Q
О
н о о
Р
0.8
0.4
et al, 2008). Зимография белков культуральной жидкости позволила выявить изоформы внеклеточной протеиназы P. mirabilis с молекулярными массами 52 и 50 кДа (Oliver et al., 1999). Причины образования двух изоформ точно не известны. Предполагается, что изоформа с М = 5
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.