ПОЧВОВЕДЕНИЕ, 2011, № 8, с. 966-972
БИОЛОГИЯ ПОЧВ
УДК 582.282.23.095:574
ОСОБЕННОСТИ ДИНАМИКИ ЭПИФИТНЫХ И ПОЧВЕННЫХ ДРОЖЖЕВЫХ СООБЩЕСТВ В ЗАРОСЛЯХ НЕДОТРОГИ ЖЕЛЕЗКОНОСНОЙ НА ПЕРЕГНОЙНО-ГЛЕЕВОЙ ПОЧВЕ*
© 2011 г. А. М. Глушакова, А. В. Качалкин, И. Ю. Чернов
Факультет почвоведения МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991, Москва, Ленинские горы
Поступила в редакцию 15.11.2010 г.
Исследована круглогодичная динамика численности и таксономического состава дрожжевых сообществ в филлосфере, цветках, на корнях недотроги железконосной (Impatiens glandulifera Royle.) и в перегнойно-глеевой почве под ее зарослями. Показано, что на листьях этого однолетнего гигрофита формируются характерные для филлосферы дрожжевые сообщества с доминированием краснопиг-ментированных видов Rhodotorula mucilaginosa, Rhodotorula glutinis, а также типичного эпифита Cryp-tococcus magnus. Однако в перегнойно-глеевой почве под сплошными зарослями недотроги обнаружены совершенно не характерные для почв дрожжевые группировки с доминированием аскоспоро-вых видов Saccharomyces paradoxus, Kazachstania barnettii, Torulaspora delbrueckii. При этом эпифитный и почвенный дрожжевые комплексы под зарослями недотроги представлены двумя совершенно дискретными сообществами, практически без общих видов. В других биогеоценозах лесной полосы перестройка структуры дрожжевых сообществ при переходе от наземных субстратов к подземным происходит постепенно, а большая часть видов выделяется и из надземных частей растений, и из почвы. По-видимому, эта особенность связана с тем, что однолетники-гигрофиты разлагаются очень быстро, в течение нескольких дней после первых заморозков. Поэтому под ними не формируется промежуточный между филлосферой и почвой подстилочный слой, где также способны развиваться эпифитные микроорганизмы.
Дрожжевые грибы являются одной из доминирующих групп эпифитных микроорганизмов, населяющих поверхность живых частей растений. Благодаря многочисленным исследованиям накопились значительные сведения о специфике дрожжевых грибов, обитающих на надземных частях растений [1, 4, 6, 12, 16, 17]. В условиях умеренного климата среди эпифитных дрожжей наиболее часто выделяются такие виды, как Сгур^-сосеин magnus, КНоёо(оги1а glutinis, КНоёо(оги1а mucilaginosa, Сгур^сосст уШопав и др. Их можно обнаружить на листьях почти любого растения [8]. В то же время особенности экологии эпифит-ных дрожжей изучены далеко не достаточно, особенно с учетом необходимости таких знаний для разработки методов биоконтроля фитопатогенов, в которых дрожжи все чаще используются в последние годы [14], а также для более эффективного скрининга дрожжевых штаммов, представляющих ценность для биотехнологии.
Вместе с тем, присутствие дрожжевых грибов характерно и для минеральных горизонтов большинства типов почв. В почве присутствует комплекс автохтонных дрожжей, проводящих в ней весь жизненный цикл. Он включает ряд видов, тесно ассоциированных с определенными типа-
* Работа выполнена при финансовом содействии РФФИ, грант 10-04-00332.
ми почв (Lipomyces spp., Cryptococcus podzolicus, C. terricola, Cr. aerius, Cr. gilvescens) [1, 3, 5, 13]. Тем не менее, наиболее многочисленны в почве ал-лохтонные виды дрожжей, которые попадают сюда с опадом. Другими словами, дрожжевое население растений сильно влияет на почвенные дрожжевые сообщества, обогащая их аллохтон-ными эпифитными видами.
Это справедливо для лесных или луговых биогеоценозов, где формируется многолетний слой растительных остатков — подстилка. Именно подстилка является тем местообитанием, которое обогащает аллохтонный микробный комплекс почвы эпифитными дрожжами. Тем не менее, в средней полосе России имеются совершенно особые фитоценозы, сложенные интродуцирован-ными однолетними растениями, очень быстро, в течение нескольких дней полностью отмирающими в конце вегетации. В результате здесь не формируется подстилка. Примером может служить Impatiens glandulifera Royle (недотрога желез-коносная). Это инвазивный рудеральный вид, использующийся как декоративное растение, но быстро дичающий и образующий сплошные заросли на открытых пространствах богатых влажных почв. После первых же заморозков недотрога полностью отмирает, ее надземные части очень быстро лизируются, обогащая верхние слои почвы легкодоступными источниками углерода. По-
добные биогеоценозы, эдификатором в которых являются однолетние растения, не типичны для средней полосы России. Однако они могут служить интересной моделью для исследования неизвестных до настоящего времени растительно-почвенных коэволюционирующих микробных сообществ.
Цель настоящей работы — выявить особенности эпифитных и почвенных дрожжевых сообществ в фитоценозах, представленных однолетниками, не формирующими подстилки, на примере зарослей I. glandulifera.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ
В качестве объекта исследования недотрога I. glandulifera была выбрана по следующим причинам.
1. Это типичный гигрофит, а как было показано ранее, в филлосфере гигрофитов наблюдается максимальная численность эпифитных дрожжевых грибов [7]. Кроме того, на ее листьях имеются экстрафлоральные нектарники, что увеличивает количество доступных сахаров для эпифитных микроорганизмов.
2. Цветки недотроги крупные, собраны в соцветия, опыляются в основном шмелями. В таких цветках всегда много характерных для энтомофиль-ных растений видов аскомицетовых дрожжей из родов Metschnikowia, Debaryomyces, Candida.
3. Это однолетнее растение с хорошо развитой системой придаточных корней. И главное, I. glandulifera представляет собой удобный модельный объект для исследования, так как можно проследить всю динамику развития микроорганизмов на растении, начиная от проростков и заканчивая полным отмиранием в один год, и легко повторить на следующий год — растение всегда массово возобновляется семенами будущей весной.
Исследования проводили в 2008—2009 гг. на территории Измайловского парка г. Москвы и в окрестностях г. Бронницы Московской области. Анализировали четыре типа субстратов: цветки, листья, корни и почву (0—5 см) под растениями. Листья отбирали в течение всего периода вегетации, начиная с июня и заканчивая поздней осенью, когда они полностью разлагались в течение нескольких дней после первых заморозков. Придаточные корни анализировали, начиная от зачаточного состояния весной, и до полного разложения в ноябре. Цветки исследовали, начиная с периода бутонов — начала распускания в конце июня, и до полного завядания и образования плодов в августе. Сбор образцов проводили один— два раза в неделю. Всего было проанализировано 1382 образца. Непосредственно после сбора образцы измельчали, отбирали 5—10 навесок массой 0.5—1 г. Навески помещали в пробирки и залива-
ли стерильной водой для получения разведения 1 : 50 для листьев и цветков, и 1 : 10 для корней и почвы. Суспензию обрабатывали на вортексе (MultiReax, Heidolph, Germany) в течение 10 мин. Образцы высевали на подкисленную 80%-ной молочной кислотой (4 мл/л) глюкозо-пептонную среду (глюкоза 20 г/л, пептон 10 г/л, дрожжевой экстракт 5 г/л, агар 10 г/л) в двукратной повтор-ности. Посевы инкубировали при комнатной температуре 5—14 дней. Выросшие колонии дрожжей с помощью бинокулярной лупы разделяли на морфологические типы, и подсчитывали число колоний каждого типа. Представителей каждого типа колоний выделяли в чистую культуру. Культуры дрожжей идентифицировали по морфологическим и физиологическим признакам [15] и с помощью анализа нуклеотидных последовательностей D1/D2 региона 26S (LSU) рДНК.
Выделение ДНК проводили по следующей методике: биомассу (2 захвата петли) 3-4-х суточной культуры переносили в 2 мл эпендорфы, добавляли 400 мкл стеклянной дроби (300—500 мкм диаметром) и 500 мкл лизирующего буфера (Tris Base 50 mM, NaCl 250 mM, ЭДТА 50 mM, SDS 0.3%, pH 8). Приготовленную смесь взбалтывали на вортексе на максимальной скорости 15 мин, затем инкубировали 1 ч при температуре 65°С, после снова трясли на вортексе 15 мин и центрифугировали (13.4 rpm) 10 мин, отбирали надоса-дочную жидкость.
Для амплификации региона рДНК, содержащего D1/D2 домен региона 26S рДНК, использовали праймеры ITS1f (5' -CTTGGTCATTTAGAG-GAAGTA) и NL4 (5' -GGTCCGTGTTTCAA-GACGG) и смеси для ПЦР ScreenMix (ЗАО "Евроген", Москва). Амплификатор использовали по следующей программе: (начальная денатурация — 2 мин при температуре 96°С; затем 35 циклов: денатурация — 20 с при температуре 96°С, отжиг праймеров — 50 с при температуре 52°С, синтез ДНК — 1.5 мин при температуре 72°С; конечная достройка 7 мин при температуре 72°С). Очистку ПЦР-продукта проводили с использованием набора BigDye XTerminator Purification Kit ("Applied Biosystems", USA). Для секве-нирования использовали праймер NL4. Секвени-рование ДНК проводили с помощью набора реактивов BigDye Terminator V3.1 Cycle Sequencing Kit ("Applied Biosystems", USA) с последующим анализом продуктов реакции на секвенаторе Applied Biosystems 3130xl Genetic Analyzer в Научно-производственной компании "Синтол" (Москва). Идентификацию по полученным хро-матограммам проводили, используя данные ген-банка NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/). Для каждого образца определяли общую численность дрожжей и относительное обилие каждого вида.
4 -
9
8
7
6
5
3
2
01.04 21.05 10.07 29.08 18.10 07.12 26.01 17.03
Даты
Рис. 1. Динамика общей численности дрожжей на различных частях Impatiens glandulifera. Обозначения здесь и далее: 1 — листья, 2 — цветки, 3 — корни, 4 — почва.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Общая численность дрожжевых грибов в фил-лосфере и в цветках недотроги изменялась в зависимости от времени года и стадии онтогенеза растения (рис. 1). На листьях численность дрожжей колебалась в пределах 104—105 КОЕ/г в течение лета и в начале осени. Однако в октябре, незадолго перед скоротечным отмиранием, сразу после первых осенних заморозков она резко возросла и составила порядка 107 КОЕ/г. Аналогичные изменения наблюдались и в цветках. Численность дрожжей здесь также начала возрастать в период отмирания цветов в сентябре, а не во время массового цветения в июле.
Численность дрожжевых грибов н
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.