МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2004, том 38, № 5, с. 786-797
= ДНК-БЕЛКОВЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ
УДК 577.15.03
ОСОБЕННОСТИ ДНК-БЕЛКОВЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ В ТРАНСКРИПЦИОННЫХ КОМПЛЕКСАХ Escherichia coli
© 2004 г. О. Н. Озолинь*, Ю. А. Пуртов, А. С. Брок-Волчанский, А. А. Деев1, В. И. Лукьянов
Институт биофизики клетки Российской академии наук, Пущино, Московская обл., 142290 1Институт теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук, Пущино,
Московская обл., 142290 Поступила в редакцию 18.11.2003 г.
Идентификация ДНК-белковых и белок-белковых контактов в транскрипционных комплексах является необходимым этапом аннотации каждого промотора. Используемые с этой целью экспериментальные подходы позволяют определить принадлежность промотора к регулону одной из семи альтернативных о-субъединиц РНК-полимеразы и зависимость его активности от известных факторов белковой и небелковой природы. Такая информация содержится и в нуклеотидной последовательности промоторной ДНК, поэтому, зная стартовую точку транскрипции, с высокой точностью можно предсказать тип промотора и способ его белковой регуляции. Значительно сложнее предсказать матричную активность промотора, которая зависит не только от специфических контактов между о-субъединицами и соответствующими консенсусными элементами, но и от множества пока не поддающихся простому учету неспецифических факторов. В обзоре рассмотрены особенности контактов, формируемых а-субъединицами РНК-полимеразы, по-видимому, без участия функциональных групп азотистых оснований. Предпринята попытка сопоставить нуклеотидные последовательности промоторов разных типов в местах потенциального связывания а-субъединиц и обсудить возможное значение этого взаимодействия для регуляции транскрипции.
Ключевые слова: промотор, РНК-полимераза, консервативные элементы, альтернативные о-фак-торы, а-субъединица, Escherichia coli.
SPECIFICIETY OF DNA-PROTEIN INTERACTIONS WITHIN TRANSCRIPTION COMPLEXES OF Escherichia coli, by O. N. Ozoline*, Yu. A. Purtov, A. S. Brok-Volchanski, A. A. Deev1, V. I. Lukyanov (Institute of Cell Biophysics Russian Academy of Sciences, Pushchino, 142290 Russia; *E-mail: ozo-line@mail.icb.psn.ru ; institute of Theoretical and Experimental Biophysics Russian Academy of Sciences, Pushchino, 142290 Russia). Current requirement for description of each new promoter assumes identification of all DNA-protein and protein-protein contacts important for transcription complex formation. Experimental approaches allow estimating which one of seven alternative о-subunits is employed for RNA synthesis and verifying transcription dependence on known regulatory proteins. Promoter sequence by itself also contains this information. That is why, the type of promoter as well as potential regulatory proteins with high probability may be proposed, if the transcription start point has been determined. Transcription activity of the promoter is usually less predictive. It depends on the specific contacts formed by о-subunits with correspondent conservative elements and on many other non-specific factors that are hardly taken into account. Interaction with RNA polymerase а-subunits seems does not require any particular functional group of nucleotides thus exemplifying non-sequence-specific binding within binary polymerase-promoter complexes. The role of this interaction in the transcription complex formation is the main subject of this survey that summarizes our own experimental results and the data of other authors. Attempts have been made to compare nucleotide sequences of the promoters recognized by different o-factors within putative contact regions with а-subunits and to discuss regulatory propensity of free а-subunits.
Беспрецедентная вырожденность консервативных элементов бактериальных промоторов значительно усложняет возможность их эффективного узнавания РНК-полимеразой с ис-
Принятые сокращения: FeBABE - Fe(S)-1-(p-бромоацета-мидбензил)-этилен-диаминотетраацетат; AcHAQO - моно-ацетил-4-гидроксиаминогуинолин 1-оксид.
* Эл. почта: ozoline@icb.psn.ru
пользованием стандартного алгоритма. Однако она же создает основу для дифференциальной экспрессии нескольких тысяч генов и реализации разнообразных регуляторных механизмов. Вероятно, именно поэтому в геноме Escherichia coli только один вегетативный промотор имеет все 12 консервативных пар (metY-P1), но и у него длина участка между консенсусными элементами отличается от оптимальной. Большинство промото-
ров содержат только семь или восемь консервативных пар. В бактериальной ДНК число мест, имеющих такую степень совпадения с консервативными элементами, на 1-2 порядка превышает число генов. Это значит, что некоторое соответствие консенсусу является необходимым, но недостаточным условием для формирования продуктивного комплекса с РНК-полимеразой, а в нук-леотидных последовательностях промоторов есть элементы, повышающие вероятность транскрипции с настоящих промоторов. К ним, в частности, относятся элементы, обеспечивающие оптимальную для формирования транскрипционного комплекса конформацию ДНК, но избирательность транскрипции сильнее всего зависит от элементов, вступающих в непосредственный контакт с РНК-полимеразой или регуляторами транскрипции.
Самый важный фактор, который определяет эффективность транскрипции конкретного гена, это, безусловно, РНК-полимераза нужного полипептидного состава. В условиях вегетативного роста наиболее представлен фермент, в качестве фактора промоторной специфичности содержащий белковый продукт гена rpoD - aD. Такая по-лимераза способна взаимодействовать с большинством бактериальных промоторов и транскрибировать почти все гены. Помимо aD, у Escherichia coli известны еще шесть а-субъеди-ниц: aS, ан, аЕ, aF, aN и aFecI [1]. Они заменяют aD в комплексе с кор-ферментом и узнают характерные для них последовательности оснований. Альтернативные а-субъединицы нужны клетке на определенных этапах развития (aS) и в различных стрессовых условиях (аЕ, ан и aS), но и во время нормального роста содержащие их полимеразы транскрибируют ряд оперонов. Так, например, содержание в клетках aD сопоставимо с aN и aF [2], которые контролируют экспрессию сравнительно небольшого числа генов. Относительное содержание разных а-факторов определяется эффективностью транскрипции соответствующих генов, стабильностью РНК-продуктов, белка и присутствием анти-а-факторов (Rsd в случае aD; RseA для аЕ; FlgM для aF; FecR для aEecI и DnaJ-DnaK для ан) [3-6]. Гены, высокий уровень экспрессии которых необходим в разных условиях, обычно содержат промоторы нескольких типов. Так перед геном rpoD, кроме трех вегетативных промоторов, находятся промоторы ан и аЕ, а ген дНК-топоизомеразы, topA, может транскрибироваться с участием aD, ан и aS.
Помимо альтернативных а-факторов на эффективность транскрипции индивидуальных генов влияют специальные регуляторные белки, которые не входят в состав РНК-полимеразы, но способны связываться с нею и/или с соответствующими нуклеотидными последовательностями в промоторах. Таких белков у E. coli, по-видимому,
более 200 [7], а набор используемых молекулярных механизмов чрезвычайно разнообразен. Он включает простую конкуренцию с полимеразой или другими регуляторными белками за места специфического контакта; стабилизацию образованных комплексов за счет дополнительных белок-белковых взаимодействий; модификацию структурно-конформационного состояния про-моторной ДНК и др. Уровень синтеза специфических регуляторов транскрипции без индукции обычно низок. При необходимости он может возрастать в сотни раз, а размеры контролируемых регулонов варьируют от одного до сотен генов, причем в состав этих регулонов могут входить гены, экспрессируемые с промоторов разных а. Один и тот же регуляторный белок может активировать синтез РнК с одних промоторов и ингиби-ровать с других, взаимодействуя с а, а, в или в'-субъединицами РНК-полимеразы (классы I-IV соответственно [1]) или не взаимодействуя с ними.
Продуктивность транскрипции зависит от множества разных небелковых соединений, в том числе ppGpp и тРНКЕте1, от солевого состава цитоплазмы и суперскрученности ДНК, а также от 10-20 ДНК-связывающих белков, упаковывающих ее в относительно компактный нуклеоид [8]. Одни из них (Rob, DnaA, Fis, IHF и Lrp) обладают специфичностью к определенным последовательностям оснований, другие - к структурным особенностям двойной спирали (CbpA, H-NS, Hfq, IciA), а некоторые взаимодействуют с ДНК только неспецифически (Dps, HU, StpA) [9]. Изменяя конформационное состояние ДНК, белки нукле-оида влияют на все ее функциональные свойства и могут как активировать, так и ингибировать транскрипцию [10]. Белки нуклеоида содержатся в клетке в больших количествах [11], они необходимы для адекватной экспрессии многих генов. Так в регулон H-NS входят более 50 генов [12]. Кроме того, относительно недавно обнаружили нетранслируемые РНК, способные воздействовать на транскрипцию, взаимодействуя с субъединицами РНК-полимеразы [13] или регуляторными белками [14, 15].
Очевидно, что функциональное проявление всех дополнительных элементов зависит от прочности бинарных комплексов полимераза-промо-тор. Кроме а-субъединиц, взаимодействующих с консервативными парами, эта прочность зависит от ДНК-белковых контактов, формируемых двумя а-субъединицами РНК-полимеразы. Анализу роли а-субъединиц в образовании транскрипционного комплекса и посвящена эта статья.
ЭЛЕМЕНТЫ СПЕЦИФИЧЕСКОГО УЗНАВАНИЯ ПРОМОТОРОВ а-СУБЪЕДИНИЦАМИ
Основную роль в образовании транскрипционного комплекса играют а-субъединицы РНК-по-
о°(400) a S (50) а S (50)
+ 1 I
ТТсаса--------------ХС -ТАтааТ-----¥И
сТбс Ал................СТАтАсТ-----УК
ттсаса-------...-------стА5а£Т-----УК
ан(25) т--т--2-2ТТСАа--------------ССССАТ та----та
аЕ(25) сААтТТ----------------тСтСА------*
а^14) ат-ТТАААА-СТСССАСАА- Т-ТТССАТТ-------та
а р(5) т аАас- - -т..........сССсаТаА------*
Рис. 1. Консенсусные элементы промоторов разных типов. Степень консервативности пар, рассчитанная после выравнивания промоторов по ранее предложенным консенсу
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.