ЖУРНАЛ ВЫСШЕЙ НЕРВНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ, 2007, том 57, № 6, с. 692-701
ФИЗИОЛОГИЯ ПОВЕДЕНИЯ; ОБУЧЕНИЕ И ПАМЯТЬ
УДК 575.1:591.185:599323.4:616-00912
ОСОБЕННОСТИ ДВИГАТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ КРЫС НИСАГ В ТЕСТЕ ОТКРЫТОГО ПОЛЯ КОНТРОЛИРУЮТСЯ ГЕНАМИ
2-Й И 16-Й ХРОМОСОМ
© 2007 г. О. Е. Редина1, С. Э. Смоленская1, Л. Н. Маслова1, Д. Г. Сахаров2, А. Л. Маркель1
1 Институт цитологии и генетики СО РАН,
2 Институт физиологии РАМН, Новосибирск
e-mail: oredina@bionet.nsc.ru Поступила в редакцию 08.02.2007г. Принята в печать 16.05.2007 г.
Путем идентификации локусов полигенных признаков (QTL анализ) исследовали особенности генетической детерминации поведения крыс с наследуемой индуцируемой стрессом артериальной гипертензией (линия НИСАГ). Анализ проводили на двух популяциях самцов гибридов F2 (НИСАГ х WAG) разного возраста: 3-4 (n = 106) и 6 мес (n = 130). На хромосоме 2 и на хромосоме 16 в молодой популяции крыс F2 были найдены достоверные ассоциации двух характеристик поведения крыс НИСАГ с генетическими локусами: а) для двигательной активности крыс на периферии площадки открытого поля в районе маркеров D2Rat157-D2Rat88 (LOD score 4.83, p = 0.000058) и в районе маркера D16Rat32 (LOD score 3.71; p = 0.00023). Эти два локуса совместно описывают 42.9 % вариабельности признака; б) для признака двигательной активности крыс в 1-ю минуту теста открытого поля около маркера D16Rat58 (LOD score 3.78; p = 0.00028). Результаты QTl анализа указывают на зависимость генетического контроля изученных признаков от возраста животных.
Ключевые слова: QTL анализ, поведение в тесте открытого поля, крысы линии НИСАГ.
The ISIAH Rat Locomotion in the Open Field Test is Under Control of the Genes on Chromosome 2 and Chromosome 16
O. E. Redina, S. E. Smolenskaya, L. N. Maslova, D. G. Sakharov, A. L. Markel
Institute of Cytology and Genetics, Rissian Academy of Sciences, Siberian Branch Institute of Physiology, Russian Academy of Medicals scieces, Siberian Branch, Novosibirsk
e-mail: oredina@bionet.nsc.ru
The QTL analysis was performed in order to identify the genetic loci that contribute to the behavior in the open field tests in the ISIAH rat strain with inherited stress-induced arterial hypertension. Two F2 populations of 3-4-month-old (n = 106) and 6-month-old (n = 130) male rats derived from a cross between the normotensive Wistar albino Glaxo (WAG) and hypertensive ISIAH rats were used in the search for the QTL. In 3-4-month-old rats, QTL were found: a) for the rat locomotion at the periphery of the open field in the region of D2Rat157-D2Rat88 markers (logarithm of odds (LOD) score 4.83; p = 0.000058) on Chr. 2 and in the vicinity of the D16Rat32 marker (LOD score 3.71; p = 0.00023) on Chr. 16. These two QTL describe the 42.9 % of the trait variability. b) for the rat locomotion during the first minute of the open field test on Chr.16 near the D16Rat58 marker (LOD score 3.78; p = 0.00028). The results provided support for the existence of the age-dependent differences in the genetic control of the traits analyzed.
Key words: QTL analysis, behavior in the open field tests, ISIAH rat strain.
Вопросы генетической детерминации поведения давно находятся в центре внимания исследователей. Трудность работ в данной области объясняется тем, что поведенческие реак-
ции животных и человека контролируются большим числом генов и, кроме того, подвержены значительному влиянию внешней среды [19]. Тем не менее в настоящее время широко
проводятся работы, направленные на поиск генетических локусов, детерминирующих поведенческие признаки.
Одним из подходов для изучения генетической основы проявления полигенных признаков, в том числе и поведения, является QTL метод, позволяющий находить локусы генов, контролирующих проявление исследуемого признака [7, 9, 30]. Суть метода заключается в том, что геномы экспериментальных животных метятся с помощью полиморфных микро-сателлитных ДНК-маркеров. Затем в гибридных генетически расщепляющихся популяциях исследуют ассоциации маркированных участков (локусов) хромосом с изучаемым феноти-пическим признаком. Статистическая оценка достоверности влияния маркированного локуса на фенотипический признак проводится путем вычисления критерия правдоподобия (LOD score).
Поведение животных традиционно изучается в тестах открытого поля [6, 22]. В тесте открытого поля регистрируются такие характеристики поведения, как двигательная активность, исследовательские реакции и реакции страха и избегания незнакомой обстановки, способность адаптироваться и обучаться стратегии поведения, наиболее адекватной для исследуемой ситуации. Таким образом, тест дает представление об основных характеристиках психоэмоциональной и поведенческой активности животных. Повышение эмоциональных реакций в ответ на действие эмоциогенных стимулов может сопровождаться существенными вегетативными и нейроэндокринными изменениями [8, 10, 11]. Показано, что повышенная эмоциональность животных может быть причиной значительного увеличения артериального давления (АД) при разных видах стресса [12, 14, 18, 21, 26]. Для изучения особенностей поведения у животных с предрасположенностью к формированию гипертонической болезни удобной моделью является линия крыс НИСАГ, полученная в результате многолетней селекции в Институте цитологии и генетики СО РАН для изучения наследуемой стресс-чувствительной артериальной гипертензии [1]. Ранее, при сравнении крыс гипертензивных линий НИСАГ и SHR с крысами нормотензивной линии WAG нами были обнаружены межлинейные различия как по поведению, так и по АД, в частности по его реакции на стресс, что позволило сделать предположение о наличии связи на генетическом уровне между особенностями поведения и уровнем АД [2]. В настоящей работе проводили по-
иск генетических локусов, ответственных за особенности поведения крыс гипертензивной линии НИСАГ в тесте открытого поля.
МЕТОДИКА Экспериментальные животные
В опытах использовали крыс гипертензивной линии НИСАГ, нормотензивной линии WAG (Wistar Albino Glaxo), гибридов F1, полученных в результате реципрокных скрещиваний: 5 НИСАГ х в WAG и 5 WAG х в НИСАГ. Между группами F1 (2 НИСАГ х в WAG), n = 12, и F1 (5 WAG x в НИСАГ), n = 10, достоверной разницы в картине поведения в тесте открытого поля обнаружено не было. Поэтому данные, полученные при исследовании реципрокных гибридов F1, были объединены. Тестирование поведения крыс родительских линий (WAG и НИСАГ) и крыс гибридов первого поколения (F1) проводили в возрасте 6 мес. Поиск генетических локусов, ответственных за поведение крыс в тесте открытого поля, проводили на двух популяциях самцов гибридов второго поколения F2 разного возраста: 3-4 мес. (n = 106) и 6 мес. (n = 126). Крыс содержали в стандартных условиях вивария, воду и пищу давали без ограничения. Все эксперименты выполнены в соответствии с международными нормами проведения работ с лабораторными животными. Процедуры стрессирования крыс и измерения уровня АД описаны ранее [25].
Исследование поведения
Не менее чем за неделю до начала опытов крыс рассаживали в одиночные клетки. Тест открытого поля проводили на самцах по ранее описанной методике с использованием разработанного авторами аппарата с полуавтоматической регистрацией поведения животного [4]. Крысу помещали на ярко освещенную огороженную стенками из оргстекла прямоугольную площадку (140 х 70 см), расчерченную на квадраты (10 х 10 см), в центре которой помещался металлический цилиндр высотой 13 см с неровной поверхностью (для привлечения внимания животного к необычным предметам). Тест продолжался 6 мин. C каждой крысой проведено четыре теста на протяжении четырех последовательных дней. В анализе использовали следующие характеристики поведения крыс в тесте открытого поля: 1) двигательная активность в 1-ю минуту первого теста открытого поля (число пересеченных квадратов, ед.); 2) двигательная активность на периферии площадки откры-
того поля (сумма пересеченных квадратов за четыре теста, ед.); 3) двигательная активность в центре площадки открытого поля (сумма пересеченных квадратов за четыре теста, ед.); 4) груминг (grooming) на периферии площадки открытого поля (число актов груминга за четыре теста, ед.); 5) вставание на задние лапы (rearing) на периферии площадки открытого поля (число вставаний за четыре теста, ед.); 6) вставание на задние лапы (rearing) в центре площадки открытого поля (число вставаний за четыре теста, ед.); 7) общее время груминга на периферии площадки открытого поля (сумма за четыре теста, с); 8) время, проведенное в центре площадки открытого поля (сумма за четыре теста, с); 9) общее время стояния на задних лапах на периферии площадки открытого поля (сумма за четыре теста, с); 10) общее время стояния на задних лапах в центре площадки открытого поля (сумма за четыре теста, с); 11) величина дефекации (число болюсов за четыре теста, ед.); 12) латентный период (время от помещения на площадку до начала локомоции, сумма за четыре теста, с).
Исследование функции коры надпочечников
У экспериментальных животных измеряли концентрацию кортикостерона в плазме крови в покое и при стрессе методом конкурентного белкового связывания [5]. Для изучения гормональной реакции коры надпочечника на стресс крысу помещали на 0.5 ч в тесную цилиндрическую клетку из проволочной сетки, диаметр которой соответствовал размерам тела животного, что обеспечивало его иммобилизацию (ре-стрикционный стресс). Кровь из хвостовой вены брали через 0.5 ч после начала стресса. После окончания стресса крыс возвращали в домашние клетки. Через неделю крыс мгновенно дека-питировали. В полученной плазме крови определяли базальный уровень кортикостерона.
Выделение ДНК
ДНК выделяли из ткани печени с использованием протеиназы К и фенольной экстракции по стандартной методике [28]. Далее ДНК переосаждали и растворяли в деионизированной воде.
Микросателлитные маркеры
и полимеразная цепная реакция (ПЦР) на геномной ДНК крыс
Микросателлитные маркеры подбирали из баз данных http://www-genome.wi.mit.edu и http://www.well.ox.ac.uk. Относительное поло-
жение
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.