ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2015, том 62, № 4, с. 594-601
ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТЫ
УДК 581.1
ОСОБЕННОСТИ ДЫХАНИЯ И ОБРАЗОВАНИЯ СТЕРОИДНЫХ ГЛИКОЗИДОВ В СУСПЕНЗИОННОЙ КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК Dioscorea deltoidea ПРИ ВЫРАЩИВАНИИ В КОЛБАХ И БИОРЕАКТОРАХ
© 2015 г. М. В. Титова*, **, Н. А. Шумило*, И. Е. Куличенко*, И. М. Иванов*,
Е. С. Суханова*, **, А. М. Носов*, **
*Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, Москва **Биологический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Москва Поступила в редакцию 11.11.2014 г.
При масштабировании аппаратного выращивания культур клеток высших растений до промышленных объемов важной задачей является мониторинг физиологического состояния клеточной популяции. Исследования проводили на культуре Dioscorea deltoidea Wall — штамме-продуценте стероидных гликозидов (протодиосцина и дельтозида), для которого при полупроточном выращивании в барбо-тажных биореакторах (20 и 630 л) определяли ростовые характеристики и содержание фуростаноло-вых гликозидов; в экспоненциальной фазе роста измеряли общую скорость поглощения кислорода и долю участия в этом процессе альтернативной оксидазы (АО). Для каждого аппарата измерения проводили на протяжении 3—4 циклов субкультивирования, начиная со второго цикла от момента инокуляции. Значения коэффициентов массопередачи по кислороду (KLa, ч-1) для биореакторов определяли при режимах перемешивания и аэрации, оптимальных для выращивания штамма. Максимальную долю цианидрезистентного дыхания отмечали при выращивании в 20-литровом барботажном биореакторе с точечным аэрирующим устройством (до 60-65% от общей интенсивности дыхания). Для этого же аппарата были получены минимальные значения KLa (2.0-2.4 ч-1), а также более низкий уровень содержания фуростаноловых гликозидов (4.2-8.0% от сухой массы клеток). По-видимому, подобный эффект был обусловлен недостаточно равномерным распределением кислорода в культу-ральной среде. Минимальная активность АО (в пределах 15-25%) была отмечена для системы с более интенсивным массообменом по кислороду - в 630-литровом барботажном биореакторе с кольцевым аэратором (KLa 7.1-8.0 ч-1). В этом же биореакторе обнаружили более высокие биосинтетические показатели (7.7-13.9% от сухой массы клеток).
Ключевые слова: Dioscorea deltoidea — суспензионная культура растительных клеток — стероидные гли-козиды — биореакторы — дыхание — коэффициент массопередачи по кислороду КЬа
DOI: 10.7868/S0015330315040168
ВВЕДЕНИЕ
Для создания эффективной технологии получения целевых продуктов вторичного метаболизма и биомассы культур растительных клеток необходим комплекс специальных исследований: получение штамма-продуцента с высокими ростовыми и биосинтетическими характеристиками, подбор оптимальных режимов выращивания, а также изучение возможностей масштабирования процесса
Сокращения: АО — альтернативная оксидаза; К^ — коэффициент массопередачи по кислороду.
Автор для корреспонденции: Титова Мария Владимировна. 127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН. Электронная почта: titomirez@mail.ru
культивирования до биореакторов полупромышленного и промышленного объемов. В частности, при оптимизации выращивания культур клеток в биореакторах отсутствие или недостаток данных о влиянии технологических условий культивирования на клеточный метаболизм может приводить к проблемам регулирования процессов роста и биосинтеза и как следствие к снижению количества и качества получаемого продукта [1—3].
При глубинном культивировании растительных клеток необходимо обеспечивать высокую интенсивность массообмена клеток со средой. Поскольку низкое содержание кислорода является одним из основных лимитирующих факторов процессов выращивания суспензионных клеточ-
ных культур, для характеристики массообменных свойств системы использовали коэффициент мас-сопередачи по кислороду [4—8]. В культуре необходимо постоянно поддерживать концентрацию кислорода на оптимальном для конкретного продуцента уровне, при этом скорость поступления кислорода к клеткам с учетом выхода в атмосферу должна превышать скорость его включения в клетки. В околоклеточном пространстве не должно возникать так называемых "концентрационных ям" [4—5, 7]; клетки, растворенный кислород и субстрат должны быть равномерно распределены по всему объему колбы или биореактора. Поэтому перемешивание также является одним из основных факторов, обеспечивающих оптимальные условия выращивания. Показано, что эффективность перемешивания зависит от конфигурации перемешивающих и аэрирующих устройств и геометрии самой системы культивирования [7, 8].
Комплексное изучение непрерывного глубинного культивирования с учетом как продуктивности и физиологических особенностей культур растительных клеток, так и технологических характеристик используемого оборудования до сих пор не получили широкого распространения. Однако имеющиеся в литературе немногочисленные примеры подтверждают, что подобный подход дает дополнительные возможности для повышения продуктивности процесса по всем параметрам [3].
В нашей работе был использован штамм ИФР ДМ-0.5 суспензионной культуры Dioscorea del-toidea Wall, который является сверхпродуцентом фуростаноловых гликозидов (до 10% протодиос-цина и дельтозида от сухой массы клеток). Уникальной особенностью штамма является полное отсутствие спиростаноловых гликозидов [9, 10]. Совместно с сотрудниками Института биохимии им. А.Н. Баха РАН был разработан эффективный способ выделения фуростаноловых гликозидов без применения препаративной хроматографии [11]. Получаемый таким способом препарат обладает высокой биологической активностью и может быть использован как иммуномодулятор для коррекции иммунодефицитных состояний разной этиологии (пострадиационный, постстрессовый, опухолеассоциированный), как секс-стимулятор и индуктор фитоиммунитета [10, 11].
Штамм ИФР ДМ-0.5 имеет характеристики, приемлемые для разработки промышленной технологии получения биомассы, и хорошо растет в биореакторах различных типов как в периодическом, так и в проточном и полупроточном режимах [10, 12-14].
Исследование процесса непрерывного длительного выращивания суспензионной культуры D. deltoidea с учетом как метаболической активности клеток в процессе роста (кинетики накопления биомассы и фуростаноловых гликозидов и
изменения дыхательной активности), так и технологических ограничений, обусловленных особенностями аппаратурного оформления, представляет собой актуальную научную и практическую задачу.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Выращивание культуры. В качестве объекта исследования использовали суспензионную культуру клеток Dioscorea deltoidea Wall — штамм-сверхпродуцент фуростаноловых гликозидов ИФР ДМ-0.5 (депонирован в ВККК ВР ИФ РАН, коллекционный № 6).
Культуру выращивали на модифицированной среде с минеральной основой по Murashige и Skoog [15] с добавлением сахарозы, витаминов и фито-гормонов (в соответствии с коллекционным паспортом). Для всех вариантов культивирования использовали инокулюм в концентрации 2.0—2.8 г/л (по сухому весу) при жизнеспособности культуры 87-93%.
Культивирование проводили в колбах и в биореакторах. Для выращивания суспензионных культур в колбах на круговой качалке использовали колбы объемом 0.5-2.0 л. Цикл субкультивирования составлял 2 нед. Культивирование проводили в темноте при температуре 26-27°C, влажности 7075% и частоте оборотов качалки 95-100 об./мин.
Для аппаратурного выращивания использовали барботажные биореакторы двух типов: 1) барбо-тажный соплоконусный ферментер (разработка Отдела биологии клетки и биотехнологии РАН); общий объем 20 л; рабочий объем 15 л; точечное аэрирующее устройство; 2) барботажный аппарат (1Т, "ОКБА", Йошкар-Ола); общий объем 630 л; рабочий объем 550 л; аэрирующее устройство кольцевого типа.
Для снижения степени повреждения клеток при перемешивании на начальных фазах роста устанавливали минимальный расход воздуха на барботаж по отсутствию седиментации клеток в пределах 0.1-1.0 л/мин в зависимости от типа биореактора и дыхательной активности культур, обеспечивая различные значения коэффициента мас-сопередачи по кислороду (KLa, ч-1). Концентрацию растворенного кислорода рО2 поддерживали на уровне 10-40% от насыщения при отсутствии интенсивного пенообразования. Температуру суспензии поддерживали на уровне 26 ± 0.5°C.
Для определения сырой и сухой массы суспензию фильтровали с помощью воронки Бюхнера под вакуумом, промывали на фильтре дистиллированной водой и высушивали до постоянного веса при 55-60°C. Жизнеспособность клеток определяли под микроскопом как процент не-окрашиваемых 0.025% синькой Эванса клеточ-
Таблица 1. Коэффициенты массопередачи по кислороду КЬа в бесклеточной среде для различных систем культивирования
Колбы, 250 мл Биореактор, 20 л Биореактор, 630 л
Параметр круговая качалка точечное аэрирующее устройство аэрирующее устройство кольцевого типа
*La, ч-1 6.4-7.2 2.0-2.4 7.1-8.0
ных агрегатов. Просчитывали не менее 250 агрегатов в трех повторностях.
Для подсчета числа клеток 0.5 мл суспензии инкубировали с 2.0—2.5 мл 20% хромовой кислоты при 60°С в течение 15—20 мин в зависимости от возраста и типа суспензии. Число клеток подсчитывали в камере Фукса—Розенталя.
Полярографический метод определения вкладов различных путей дыхания в общее поглощение кислорода. Определение вкладов различных путей дыхания производили при помощи полярографической установки с ячейкой открытого типа и электродом Кларка при 27°С. Для измерений использовали суспензию клеток (из расчета 10 и 40 г сырой биомассы клеток в 1 л среды). Поглощение кислорода выражали в мг О2/(ч г сухой массы клеток).
Для определения вклада различных путей дыхания использовали следующие ингибиторы: азид натрия (NN3, 5 мМ), подавляющий цитохромное дыхание через цитохромоксидазный комплекс, и салицилгидроксамовую кислоту (10 мМ), блокирующую альтернативное (или цианидрезистент-ное) дыхание через альтернативную оксидазу (АО). Уровень альтернативного дыхания определяли по разнице в ско
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.