УДК 577.152.34
ОСОБЕННОСТИ ЭКСПРЕССИИ ИММУННЫХ ПРОТЕАСОМ В АСЦИТНОЙ ГЕПАТОМЕ ЗАЙДЕЛЯ, ИМПЛАНТИРОВАННОЙ КРЫСАМ BRATTLEBORO С ГЕНЕТИЧЕСКИМ ДЕФЕКТОМ СИНТЕЗА АРГИНИН-ВАЗОПРЕССИНА
© 2014 г. В. И. Мельникова*, И. И. Хегай**, Н. А. Попова**, Н. В. Лифанцева*,
Л. Н. Иванова**, Л. А. Захарова*, #
*ФГБУНИнститут биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, 119334, Москва, ул. Вавилова, 26 **Институт цитологии и генетики СО РАН, 630090, Новосибирск, пр. академика Лаврентьева, 10 Поступила в редакцию 30.04.2014 г. Принята к печати 09.07.2014 г.
Исследовано содержание общего пула протеасом, иммунных субъединиц LMP2 и LMP7, транспортеров TAP1 и TAP2, а также RT1A молекулы главного комплекса гистосовместимости (ГКГ) класса I в клетках асцитной гепатомы Зайделя на 10-й день после имплантации крысам Brattleboro c генетическим дефектом синтеза аргинин-вазопрессина (АВП) в гипоталамусе и красам линии WAG с нормально экспрессирующимся геном АВП. При помощи Вестерн-блоттинга выявлено трехкратное увеличение общего количества протеасом и иммунной субъединицы LMP2 и восьмикратное увеличение иммунной субъединицы LMP7 в гепатоме Зайделя после ее имплантации крысам Brattleboro по сравнению с крысами WAG. Различия в содержании иммунных субъединиц LMP2 и LMP7 в гепатоме Зайделя у крыс Brattleboro могут обусловливать разные функции этих протеасом, а именно, важную роль субъединицы LMP7 в развитии противоопухолевого иммунитета. Рост гепатомы Зай-деля у крыс WAG сопровождался падением уровня как общего пула протеасом, так и иммунных проте-асом по сравнению с их содержанием у крыс Brattleboro, у которых опухоль регрессировала. Анализ содержания пептидных транспортеров ТАР1 и ТАР2 в гепатоме Зайделя, имплантированной крысам Brat-tleboro и WAG, показал их выраженную экспрессию в клетках опухоли обеих линий крыс. В гепатоме Зайделя, имплантированной крысам Brattleboro, было выявлено также трехкратное увеличение содержания основной молекулы ГКГ класса I — RT1A по сравнению с содержанием в опухоли, имплантированной крысам WAG. Кроме того, с помощью проточной цитометрии было проанализировано содержание Т-лимфоцитов CD8- и СБ4-фенотипа в селезенке крыс Brattleboro и WAG на 10-й день после имплантации им гепатомы Зайделя. Показано увеличение доли Т-лимфоцитов, экспрессирующих CD8- и CD4-антигены, в селезенке крыс Brattleboro по сравнению c крысами WAG после имплантации им опухоли. Увеличение численности как цитотоксических Т-лимфоцитов, так и Т-клеток помощников может способствовать регрессии опухоли у крыс Brattleboro. В то же время уменьшение численности субпопуляций Т-лимфоцитов в селезенке крыс WAG после имплантации гепатомы сопровождалось развитием спленомегалии и ростом опухоли. На основании анализа полученных данных можно сделать вывод, что при дефиците АВП у крыс Brattleboro в гепатоме Зайделя значительно увеличивается экспрессия иммунной субъединицы LMP7 и основных молекул ГКГ класса I. Это приводит к повышению иммуноген-ности опухоли и ее уничтожению системой адаптивного иммунитета.
Ключевые слова: протеасомы, иммунные протеасомы, ГКГ класса I, транспортеры ТАР1 и ТАР2, арги-нин-вазопрессин, мутантные крысы Brattleboro, гепатома Зайделя.
DOI: 10.7868/S0132342314060104
ВВЕДЕНИЕ
Исследования молекулярных и клеточных механизмов регуляции роста и регрессии злокачественных новообразований остаются актуальной задачей
Сокращения: ГКГ — главный комплекс гистосовместимости, АВП — аргинин-вазопрессин, ЕКК — естественные клетки-киллеры. # Автор для связи (тел.: +7(499)1358780; факс: +7(499)1358012; эл. почта: zakharova-l@mail.ru).
современной онкологии. Одним из возможных механизмов, определяющих развитие опухоли, может быть снижение эффективности представления и распознавания онкоантигенов иммунной системой [1]. Немаловажную роль в этих процессах играют иммунные протеасомы. Иммунные протеасомы представляют собой мультисубъединичные и муль-тикаталитические протеиназные комплексы эука-риотических клеток, в состав которых входят иммунные субъединицы: ЬМР7, ЬМР2 и ЬМР10
(MECL-1), или субъединицы LMP2 и LMP10, или протеасомы, содержащие только LMPT-субъедини-цы [2]. В отличие от остальных протеолитических систем клетки иммунные протеасомы с наибольшей эффективностью генерируют пептидные фрагменты, включая онкоантигены, способные образовывать комплексы с молекулами главного комплекса гистосовместимости (ГКГ) класса I для представления их Т-лимфоцитам СЭ8-феноти-па [3, 4]. Под действием иммунных протеасом существенно возрастает выход потенциальных антигенных олигопептидов с "правильным" С-концом, содержащим остатки гидрофобных аминокислот или аргинина [5, 6]. Изменение соотношения множественных форм протеасом определяет развитие злокачественных новообразований. Так, показано, что уменьшение содержания иммунных протеасом и увеличение содержания конститутивных протеасом в асцитной карциноме Krebs-II мыши вызывает ее активный рост [7].
Экспрессия иммунных протеасом взаимосвязана с экспрессией антигенов ГКГ класса I [1, 8— 10]. Низкая экспрессия антигенов ГКГ класса I способствует уходу опухоли из-под иммунного надзора и характерна для таких опухолей, как ме-ланомы, аденокарциномы простаты, рака молочной железы [1, 8]. Описаны случаи, когда низкая экспрессия антигенов ГКГ класса I обусловлена нарушениями в системе подготовки и представления антигенов, в частности при низкой экспрессии иммунных субъединиц протеасом, а также транспортеров TAP1 и TAP2, осуществляющих проникновение пептидных фрагментов антигена в эндоплазматический ретикулум [1, 9, 10]. Однако исследования, свидетельствующие в пользу этого предположения, единичны. Ранее [11] нами было показано, что увеличение содержания иммунных протеасом и снижение содержания конститутивных протеасом в клетках опухоли Walker 256, имплантированной крысам Brattleboro c генетическим дефектом синтеза [А^8]вазопрессина (ар-гинин-вазопрессина, АВП) в гипоталамусе, в отличие от родительской линии, сопровождаются регрессией опухоли. При этом длительное системное введение АВП не влияло на динамику роста и регрессии опухоли Walker 256. У крыс линии Brattleboro наблюдается гормональный дисбаланс вследствие инактивации гена АВП, вызванной делецией гуанина в кодирующей части гена и сдвига рамки считывания [12]. Отсутствие гипоталамического АВП является, по-видимому, важным условием, влияющим на формирование особенностей системы иммунитета в онтогенезе крыс Brattleboro, что может приводить к регрессии опухоли. В отличие от родительской линии, у крыс Brattleboro повышена активность естественных клеток-киллеров (ЕКК), контролирующих развитие противоопухолевого иммунитета. Длительное введение АВП крысам Brattleboro не вли-
яло не только на развитие опухоли Walker 256, но и на активность ЕКК [13].
Связаны ли наблюдаемые изменения соотношения иммунных и конститутивных протеасом с особенностями роста и регрессии опухоли Walker 256 у крыс Brattleboro или они характерны и для других типов опухолей?
Цель настоящей работы — исследовать содержание общего пула протеасом, иммунных субъединиц LMP2 и LMP7, пептидных транспортеров TAP1 и TAP2, а также RT1A молекулы ГКГ класса I в клетках асцитной гепатомы Зайделя после ее имплантации мутантным крысам Brattleboro и красам WAG с нормально экспрессирующимся геном АВП.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Содержание различных форм протеасом и транспортных молекул ТАР1 и ТАР2 в гепатоме Зайделя, имплантированной крысам Brattleboro и WAG
Относительное содержание протеасом исследовали в асцитной гепатоме Зайделя в период ее регрессии на 10-й день после имплантации крысам линии Brattleboro по сравнению с крысами WAG. Методом Вестерн-блоттинга оценивали экспрессию субъединиц а1,2,3,5,6,7 и иммунных субъединиц LMP2 и LMP7. Анализ полученных данных показал, что содержание различных субъединиц протеасом в опухоли, имплантированной крысам Brattleboro, отличается от такового в опухоли у крыс WAG (рис. 1). В опухоли у крыс Brattleboro содержание а-субъединиц протеасом было выше, чем у WAG в 3 раза (рис. 1а), иммунной субъединицы LMP2 — выше в 3.4 раза (рис. 1б) и LMP7 — в 8 раз (рис. 1в). Совместно с субъединицей LMP2 в протеасому, как правило, встраивается и субъединица LMP10 [14]. Более низкое содержание как а-субъединиц, так и имунных субъединиц протеасом в гепатоме Зайделя, имплантированной крысам линии WAG, по сравнению с крысами Brattleboro, сопровождается активным ростом опухоли. Предварительно нами были проведены исследования динамики роста гепатомы Зайделя у крыс этих линий. Оказалось, что у крыс линии WAG с физиологически нормальной концентрацией АВП в крови опухоль прогрессивно растeт в течение первых двух недель после имплантации и, начиная с 16-го дня, регистрируются летальные исходы. В то же время формирование признаков роста асцитной опухоли в отсутствие циркулирующего АВП у крыс Brattleboro было выражено слабо, летальных исходов не наблюдалось, и содержание протеасом, особенно иммунной субъединицы LMP7, было значительно выше, чем у WAG (рис. 1).
714
МЕЛЬНИКОВА и др.
д"
н о о
£
о ч
с «
св
о
(U ^
IS
с
О
400
300
200
100
400 300 200 100 0
29-32 кДа
(в)
WAG Brattleboro
* □ WAG
Brattleboro
1200 1000 800 600 400 200 0
23 кДа 27 кДа
WAG Brattleboro WAG Brattleboro
Рис. 1. Содержание а-субъединиц протеасом (а1,2,3,5,6,7) (а), иммунных субъединиц протеасом LMP2 (б) и LMP7 (в) в асцитной гепатоме Зайделя после ее имплантации крысам WAG и Brattleboro. Приведены Вестерн-блоты белков осветленных гомогенатов и относительное содержание соответствующих субъединиц (оптическая плотность блотов). За 100% принято количество субъединиц протеасом у крыс "WAG. Приведены средние значения ± стандартная ошибка, *p < 0.05, n > 5.
0
Представленные результаты согласуются с полученными нами ранее данными [11]. В период регрессии карциносаркомы Walker 256, имплантируемой крысам Brattleboro (после 14-го дня), экспрессия иммунных субъединиц протеасом увеличивалась на 84%, тогда как содержание а-субъединиц протеасом снижалось на 30%. Рост опухоли (между 7-м и 14-м днями) сопровождался низким со
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.