ОНТОГЕНЕЗ, 2004, том 35, № 1, с. 53-60
ГЕНЕТИКА РАЗВИТИЯ
УДК 575.224.23
ОСОБЕННОСТИ ФЕНОТИПИЧЕСКОЙ ЭКСПРЕССИИ АУТОСОМНЫХ МОНОСОМИЙ ПРИ ПАТОЛОГИИ ПОСТИМПЛАНТАЦИОННОГО
РАЗВИТИЯ ЧЕЛОВЕКА1
© 2004 г. И. Н. Лебедев, С. А. Назаренко
Научно-исследовательский институт медицинской генетики Томского научного центра СО РАМН
634050 Томск, набережная р. Ушайки, д. 10 Поступила в редакцию 03.07.02 г. Окончательный вариант получен 20.02.03 г.
Аутосомные моносомии представляют тяжелую форму геномного дисбаланса, обусловливающую элиминацию зародышей человека уже на доимплантационных этапах развития. Они, как правило, являются очень редкими находками в материале спонтанно абортированных эмбрионов и плодов. Проведено молекулярно-цитогенетическое исследование кариотипа клеток 60 спонтанных аборту-сов I триместра беременности, в культурах которых была отмечена клеточная дегенерация либо полное отсутствие клеточной пролиферации, в результате чего клетки не могли быть исследованы с помощью стандартного метафазного анализа. У зародышей была выявлена неожиданно высокая частота мозаичных вариантов моносомий по хромосомам 7, 15, 21 и 22, составившая 19% от всех обнаруженных хромосомных нарушений. Летальные формы моносомий по хромосомам 7 и 15 у человека выявлены впервые, поскольку они не обнаруживаются у спонтанных абортусов при проведении стандартных цитогенетических исследований. Предложена гипотеза, объясняющая возможность прохождения зародышами с мозаичными формами аутосомных моносомий ранних этапов постимплантационного развития. Выявлены отличия в механизмах возникновения, межтканевой локализации и фенотипических эффектах клеток с моносомиями по разным аутосомам набора. Показано, что моносомии по хромосомам 7, 15, 21 и 22 в мозаичном состоянии с нормальной клеточной линией могут быть совместимы с ранними этапами постимплантационной дифференцировки цито-трофобласта. Преимущественная компартментализация клеток с моносомией по хромосомам 21 и 22 в экстраэмбриональной мезодерме, производной эпибласта, может являться критическим фактором, обусловливающим невозможность нормального морфогенеза эмбриональных структур.
Ключевые слова: моносомия аутосом, хромосомный мозаицизм, пролиферация клеток, интерфазная цитогенетика.
Доминирующим фактором патологии раннего эмбриогенеза у человека являются хромосомные аномалии, обусловливающие в среднем около 50% случаев спонтанного прерывания беременностей I триместра. Среди нарушений кариотипа у спонтанных абортусов преобладают числовые аномалии хромосом, в первую очередь трисомии по аутосомам, моносомия X и полиплоидия. В то же время такой класс геномных мутаций, как аутосомные моносомии, в материале спонтанных абортов практически не представлен. Теоретически возникновение клеток с три- или моносомией по той или иной хромосоме набора должно быть равновероятным событием вследствие ошибок реципрокной сегрегации хромосом в ходе клеточного деления. Однако, несмотря на значительную частоту аутосомных трисомий, выявляемых у спонтанных абортусов при стандартном цитоге-
1 Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (проекты < 00-04-48092, 01-04-06084).
нетическом исследовании (в среднем до 50% всех аномалий), моносомия по аутосомам регистрируется сравнительно редко, составляя 0.22-0.85% от всех обнаруживаемых нарушений кариотипа (НаззоМ й а1., 1980; Оиегпей й а1., 1987; КеИёег е! а1., 1989; Бе]шек е! а1., 1992). Наиболее вероятным объяснением данного факта может служить ранняя элиминация зародышей с таким типом геномного дисбаланса. С другой стороны, в литературе известны описания единичных случаев рождения детей с моносомией по хромосоме 21 (вйр-епЪег§ е! а1., 1972; НаПогап е! а1., 1974; РеШзз1ег е! а1., 1987; ватсю е! а1., 1988). Вполне вероятно, что фенотипические эффекты моносомий по разным хромосомам набора могут быть достаточно вариабельными и зависят от взаимодействия генетических и средовых факторов, детерминирующих ход раннего эмбриогенеза.
Гипотеза о дифференциальной селективной ценности моносомий разных хромосом набора за-
трагивает еще один важный момент, касающийся возможного изменения пролиферативных свойств клеток с определенным типом геномного дисбаланса. По сообщениям разных авторов, от 5 до 42% образцов тканей спонтанных абортусов оказываются недоступными для стандартного ци-тогенетического исследования из-за дегенерации клеток, введенных в культуру (Byrne et al., 1985; Be et al., 1997). Вследствие этого кариотипы клеток со сниженным пролиферативным потенциалом остаются вне поля зрения исследователей, что, безусловно, затрудняет получение объективных данных о структуре хромосомной изменчивости, обусловливающей раннюю эмбриональную летальность у человека. С развитием методов молекулярной цитогенетики, таких как флуоресцентная in situ гибридизация (FISH) на интерфазных ядрах и сравнительная геномная гибридизация (CGH), появилась реальная возможность исследования кариотипа некультивированных клеток. Результаты сравнительно недавно выполненных первых работ в этом направлении показали, что частота хромосомных нарушений у спонтанных абортусов, в культурах клеток которых была отмечена дегенерация, находится в пределах от 47 до 72% (Daniely et al., 1998; Lomax et al., 2000; Fritz et al., 2001). Однако особого внимания в результатах этих исследований заслуживает факт обнаружения моносомии по хромосоме 19 (Daniely et al., 1998), описания которой у спонтанных абортусов до настоящего времени не были известны. Очевидно, что молекулярно-цитогене-тическое исследование спонтанно погибших зародышей человека со сниженным клеточным пролиферативным потенциалом позволит расширить наше представление о генетических причинах эмбриолетальности у человека. В настоящей работе мы провели интерфазный FISH-анализ некультивированных клеток 60 спонтанных абортусов, в культурах которых была отмечена дегенерация или полное отсутствие клеточной пролиферации.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Образцы экстраэмбриональных тканей 146 внутриутробно погибших зародышей были получены от женщин с диагнозами анэмбриония (АЭ, 35 случаев) и неразвивающаяся беременность (НБ, 111 случаев), поставленными в ходе динамического ультразвукового обследования. Ультразвуковая диагностика состояния эмбрионов и плодов проводилась акушерами-гинекологами генетической клиники НИИ медицинской генетики ТНЦ СО РАМН. Критериями для постановки диагноза АЭ являлись отсутствие сформированного эмбриона в полости плодного мешка и несоответствие размеров плодного мешка ожидаемым размерам на соответствующем сроке
беременности. Срок прерывания таких беременностей варьировал от 5 до 12 нед. Диагноз НБ ставился при наличии сформированного в полости плодного мешка зародыша, который характеризовался несоответствием крестцово-теменного размера ожидаемой величине на текущем сроке беременности, отсутствием сердцебиения и двигательной активности. Срок прерывания таких беременностей варьировал от 6 до 12 нед.
На первом этапе исследования образцы тканей плодных оболочек вводили в длительные культуры. Культивирование экстраэмбриональных тканей и приготовление препаратов мета-фазных хромосом проводили согласно стандартным методикам, изложенным ранее (Евдокимова и др., 2000). Параллельно инициации клеточных культур был сформирован банк интерфазных ядер некультивированных клеток двух типов экстраэмбриональных тканей - цитотрофобласта хориона и экстраэмбриональной мезодермы. При постановке культуры клеток часть ворсин хориона помещали во флакон с 10 мл 1%-ного раствора цитрата натрия. Гипотоническую обработку проводили в течение 20 мин при 37°С, затем раствор из флакона удаляли и добавляли 10 мл фиксатора (метанол - ледяная уксусная кислота, 3 : 1). Фиксацию ворсин хориона осуществляли при -20°С. Через 15 мин проводили смену фиксатора. Ворсины хориона извлекали из фиксатора и помещали в эппендорфовскую пробирку с 1 мл 60%-ной уксусной кислоты. Дезагрегацию клеток цитотрофобласта проводили при комнатной температуре в течение 5 мин, после чего фрагменты хориона удаляли из пробирки. Полученную клеточную суспензию центрифугировали 5 мин при 6000 об/мин и добавляли фиксатор (метанол - уксусная кислота, 3 : 1). Через 15 мин проводили смену фиксатора.
Для получения суспензий клеток экстраэмбриональной мезодермы фрагменты плодной мембраны помещали в чашку Петри с физиологическим раствором и тщательно измельчали. Полученную суспензию (10 мл) переносили в пробирки и центрифугировали в течение 5 мин при 1000 об/мин. Надосадочную жидкость удаляли до объема в 500 мкл, осадок ресуспендировали, суспензию переносили в эппендорфовскую пробирку и центрифугировали 5 мин при 6000 об/мин. Ферментативную дезагрегацию тканей плодных оболочек проводили в присутствии коллагеназы I типа ("Sigma", США) в конечной концентрации 125 ед/мл при 37°С в течение 30-60 мин. После этого суспензию центрифугировали 5 мин при 6000 об/мин, удаляли супернатант до 200 мкл и добавляли 300 мкл 1%-ного раствора цитрата натрия. Гипотоническую обработку проводили при 37°С в течение 20 мин. На следующем этапе проводили фиксацию клеток с помощью фиксатора (метанол - уксусная кислота, 3 : 1) при -20°С в те-
чение 15 мин. Смену фиксатора осуществляли дважды. Клеточные суспензии хранили в фиксаторе при -20°С. Перед интерфазным FISH-анали-зом проводили смену фиксатора, наносили суспензии на предметные стекла и высушивали на воздухе.
Критерием отбора абортусов для интерфазного FlSH-анализа являлось либо полное отсутствие прикрепления тканевых эксплантатов к субстрату и клеточной пролиферации в культуре, либо статистически достоверное превышение срока средней продолжительности культивирования клеток до регистрации фазы дегенерации клеточных колоний (111.5 ± 49.5 дней) по сравнению с нормально пролиферирующими клетками, достигавшими фазы логарифмического роста в течение 20.5 ± 13.9 дней. Таким образом, этот показатель не менее чем в пять раз превышал срок культивирования нормально пролиферирующих клеток (Т-критерий Уайта = 1564; p < 0.0001).
Для интерфазного FISH-анализа использовали набор центромероспец
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.