РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ, 2014, том 54, № 1, с. 27-34
= РАДИАЦИОННАЯ ЦИТОГЕНЕТИКА
УДК [57+61]::539.1.04:595.773.4
ОСОБЕННОСТИ ФОРМИРОВАНИЯ РАДИАЦИОННЫХ ЭФФЕКТОВ У ИНБРЕДНЫХ ОСОБЕЙ Drosophila melanogaster, РАЗЛИЧАЮЩИХСЯ
ПО ЦИТОТИПУ © 2014 г. Е. А. Юшкова*, В. Г. Зайнуллин
Институт биологии Коми научного центра УрО РАН, Сыктывкар
Проведена сравнительная оценка чувствительности инбредных дрозофил дикого типа, различающихся по цитотипу, к действию низкоинтенсивного облучения разной продолжительности по интегральным показателям выживаемости. Установлена строгая зависимость выхода частоты радиа-ционно-индуцированных повреждений ДНК (в нейтральной версии рН) от дозы воздействия и стадий сперматогенеза. Обнаружена гиперрадиочувствительность особей линий Charolles (R-цитотип), Harwich (Р-цитотип), Oregon-R (Н-цитотип), подвергавшиеся облучению на протяжении стадий раннего сперматогенеза (сперматогонии-сперматоциты) и содержащие в генотипе транспозоны Bari1, Pи hobo соответственно. В то же время у дрозофил линии Canton-S, проявляющей дисгенные свойства на фоне нескольких цитотипов (Е, I и М), при тех же условиях эксперимента наблюдали гормезисный эффект. С повышением дозы низкоинтенсивного облучения частота повреждений ДНК либо возрастала (для Canton-S), либо была снижена (для Charolles, Harwich, Oregon-R). При этом профиль плодовитости и выживаемости особей исследуемых линий дикого типа держался на достоверно высоком уровне. Показана важная роль цитотипа и отвечающих за его формирование мобильных генетических элементов в модификации эффектов низкоинтенсивного у-излучения.
Дрозофила, стадии сперматогенеза, малые дозы ионизирующего у-излучения, гиперрадиочувствительность, гормезисный эффект, цитотип, мобильные элементы.
DOI: 10.7868/S0869803114010196
В последние годы существенно изменилось представление о генетических механизмах формирования адаптивных реакций популяций организмов на низкоинтенсивные воздействия факторов среды, включая радиацию. В этом отношении наиболее изученными защитными системами являются репарация повреждений ДНК, де-токсикация свободных радикалов, контроль клеточного цикла и апоптоз [1, 2].
Предполагается, что в природных популяциях для поддержания и сохранения генетического го-меостаза недостаточно перечисленных клеточных факторов защиты. Адекватный ответ на неблагоприятные воздействия среды частично или полностью реализуется через определенные регу-ляторные механизмы эпигенетической реакции, в основе которых лежат транспозиции мобильных генетических элементов (МГЭ) [3—5]. Более того, присутствие/отсутствие в генотипе линии транспозируемого элемента определенного типа характеризует ее дисгенный статус и цитотип [6].
Мобильные элементы генома уникальны по своей функциональности, поскольку, перемеща-
* Адресат для корреспонденции: Республика Коми, 167982 Сыктывкар, ул. Коммунистическая, 28; ФГБУН Институт биологии Коми НЦ УрО РАН; тел.: (8212) 43-06-50; факс: (8212) 24-01-63; e-mail: ushkova@ib.komisc.ru.
ясь, они могут быть не только инициаторами образования повреждений ДНК, но и способны увеличивать уровень экспрессии генов, отвечающих за устойчивость организма к вызывающему стресс фактору [7, 8]. Являясь одним из источников генетической нестабильности [9, 10], некоторые МГЭ могут включаться в процессы репарации и теломеразной регуляции [11, 12], что служит необходимым механизмом для поддержания целостности многоклеточного организма.
Исследования, затрагивающие оценку вклада цитотипа и отвечающих за его формирование мобильных генетических элементов в радиоустойчивость организмов, приоритетны и являются ключевыми в понимании механизмов проявления ответных реакций клеток на низкоинтесив-ные воздействия радиации. Цель настоящей работы - оценить особенности формирования радиационных эффектов у особей дикого типа Drosophila melanogaster, различающихся по ци-тотипу.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
Для определения цитотипа исследуемых линий дикого типа Drosophila melanogaster применяли стандартные методы оценки дисгенной сте-
рильности [13—15] и гибридологического анализа с помощью определяющих скрещиваний с те-стерными линиями [16, 17]. Опираясь на собственные эксперименты (данные не приведены) и результаты, полученные другими исследователями [18—21], дикие линии дрозофилы были классифицированы по цитотипу следующим образом:
Сanton-S — линия, для которой характерны три категории цитотипа: Е, I и М. При этом она отличается от других генотипов наличием в своем геноме LINE-подобных I-ретротранспозонов, отвечающих за формирование I-цитотипа [18].
Charolles — линия R-цитотипа, характеризующаяся как реактивная линия в I—R дисгенных скрещиваниях. Отличительной особенностью данной линии является наличие в ее генотипе Ban'1-элементов, не обладающих дисгенными свойствами [19].
Harwich — строгая линия с Р-цитотипом, имеющая в генотипе полноразмерные копии Р-тран-спозона [20].
Oregon-R — линия Н-цитотипа, отличающаяся содержанием в генотипе полных функциональных копий hobo-элемента [21].
Данные линии получены из дрозофильной коллекции Центра в Блумингтоне (Университет штата Индиана, Блумингтон, США).
Эксперимент по изучению радиочувствительности дрозофил дикого типа проводили на генетически гомогенных выборках, которые получали в результате тесного инбридинга (от одной пары родителей) на протяжении четырех поколений [22]. Опытные варианты подвергали радиационному воздействию в разных режимах низкоинтенсивного у-излучения в дозах 30, 50, 70, 90 и 120 мГр (с учетом стадий сперматогенеза) [23] и 30, 50, 80, 120 и 150 мГр (без учета стадий гамето-генеза) при средней мощности экспозиционной дозы 0.40 мГр/ч. Источником у-излучения служил 226Ra (56 мГр/ч).
Все экспериментальные варианты были культивированы на стандартной питательной среде при температурном режиме 25 ± 0.1°С и периоде освещения 12 ч/сут.
Оценку реакций дрозофил на низкоинтенсивное воздействие радиации проводили с использованием стандартизированных методик: анализа плодовитости [24], имагинальной выживаемости особей [25] и частоты повреждений ДНК [26, 27].
Частоту фрагментации ДНК в соматических клетках дрозофил определяли модифицированным методом нейтрального гель-электрофореза изолированных клеток или "ДНК-комет" [26, 27]. Для получения клеточной суспензии выделенные нервные ганглии личинок третьего возраста (20 особей на вариант, на повторность) ин-
кубировали в растворе коллагеназы (тип IV, 0.5 мг / мл PBS) при температуре 37°С. Полученную суспензию клеток (10 мкл) вместе с 0.5%-ной легкоплавкой агарозой (100 мкл) наносили на предметные стекла, предварительно покрытые слоем 1%-ной нормоплавкой агарозы, и выдерживали в холодных условиях (4° С) в течение 20 мин. Далее препараты с иммобилизованными в агарозе клетками подвергали лизису (2.5 моль/л NaCl, 10 ммоль/л Na2EDTA, 20 ммоль/л Tris-HCl, 1% Triton X-100, pH 10.0) на протяжении 2 ч. Электрофорез (при условии 30 мА, 0.7 В/см, 4 °С, 20 мин) проводили в охлажденном (4°С) нейтральном буфере (0.9 моль/л Trizma-Base, 0.9 моль/л борная кислота, 20 ммоль/л Na2EDTA, рН 8.2), после чего препараты слегка подсушивали и фиксировали в 70%-ном этаноле в течение 15 мин.
Для окраски ДНК использовали раствор SYBR Green I (0.2 мкл / мл в ТЕ-буфере, рН 7.5) (ДНК-синтез, Россия). Окрашенные препараты были проанализированы с помощью флуоресцентного микроскопа "Infiniti XS-148 FS" при длинах волн возбуждения и эмиссии 494 и 521 нм соответственно. Изображение "комет" обрабатывали с использованием программы CometScore™ (версия 1.5, TriTek Corp., США). Уровень повреждений ДНК оценивали по параметру момент хвоста "кометы" по П.Л. Оливе (ОТМ, Olive tail moment — произведение расстояния от центра головы до центра плотности хвоста "кометы" на % ДНК в хвосте) [28]. Подсчитано 200 клеток на вариант на повторность (согласно трем повтор-ностям каждого опыта подсчитано 600 клеток).
Достоверность результатов оценивали с использованием t-критерия Стьюдента и ANOVA теста. Для анализа кривых выживания применяли критерий Гехана—Бреслоу—Вилкоксона (программа Statistica 7.0, StatSoft, Inc.).
РЕЗУЛЬТАТЫ
В первой серии экспериментов (рис. 1) оценивали уровень повреждений ДНК в нейробластах потомков, полученных после облучения обеих родительских форм (без учета гаметогенеза). Отмечены дозы у-излучения, в пределах которых выход цитогенетических нарушений достоверно ниже спонтанного уровня. У особей линии Сan-ton-S обнаружена низкая радиационно-индуци-рованная частота фрагментации ДНК при воздействии радиации в дозе 30 мГр, у особей Oregon-R — при 80 мГр, после чего увеличение дозы облучения ведет к резкому повышению уровня разрывов ДНК. Как и для линии Charolles, у особей линии Harwich не выявлены достоверные эффекты облучения (относительно контроля) по данному параметру.
1.8
1.5
1.2
ч о
ч
о
^ 0.9
Т О
0.6
0.3
■ Контроле 30 мГр И 50 мГр □ 80 мГр ■ 120 мГр H 150 мГр
Canton-S
Harwich Charolles Oregon-R
Линия
Рис. 1. Частота повреждений ДНК (в нейтральной версии рН) в нейробластах личинок линий дикого типа Drosophila melanogaster после воздействия низкоинтенсивного облучения. Объединены данные трех повторностей опыта. Отличия от контроля достоверны при *р < 0.05, **р < 0.01.
Во второй серии экспериментов (рис. 2) был проведен анализ изменения уровня фрагментации ДНК, происходящей на разных этапах сперматогенеза у особей, подвергшихся радиационному воздействию в малых дозах. Обнаружен гор-мезисный эффект, который проявляется в виде снижения по сравнению с контролем уровня индуцированных повреждений ДНК. Для Canton-S (рис. 2, а), характеризующейся как линия с различными цитотипическими возможностями, низкоинтенсивное облучение (при накопленной дозе 50 мГр) на более ранних стадиях сперматогенеза приводит к снижению частоты клеток с поврежденной ДНК. Для этой же линии подобную реакцию при той же самой интенсивности радиационного воздействия наблюдали в меньшей дозе (30 мГр), но только при облучении обеих родительских линий. По-видимому, для данного генотипа гормезисный эффект наиболее выражен в пределах д
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.