ОНТОГЕНЕЗ, 2008, том 39, № 2, с. 106-115
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 582.475.2:581.3:58.085
ОСОБЕННОСТИ ФОРМИРОВАНИЯ СОМАТИЧЕСКИХ ЗАРОДЫШЕЙ
__W __1
У ЛИСТВЕННИЦЫ СИБИРСКОЙ: ЭМБРИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ1
© 2008 г. А. С. Белоруссова, И. Н. Третьякова
Институт леса им. ВН. Сукачева СО РАН 660036 Красноярск, Академгородок E-mail:culture@ksc.krasn.ru Поступила в редакцию 10.07.06 г.
Окончательный вариант получен 23.07.07 г.
Для инициации соматического эмбриогенеза у лиственницы сибирской были введены в культуру in vitro зиготические зародыши на разных стадиях развития. Культивирование проводили на модифицированной среде Мурашиге и Скуга с гормонами - 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислотой (2 мг/л) и 6-бен-зиламинопурином (0.5-1 мг/л). Успешность соматического эмбриогенеза у данного вида связана с генотипом дерева и зависит от стадии развития зародышей, введенных в культуру. Наиболее активно процесс соматического эмбриогенеза протекал из незрелых зиготических зародышей на стадии заложения семядолей. Такие зародыши на 5-10-е сут формировали эмбриогенную ткань, состоящую из двух типов клеток - удлиненных, сильно вакуолизированных эмбриональных трубок и мелких эмбриональных клеток. Из пролиферирующей эмбриогенной ткани на 2-й мес культивирования выделяли соматические зародыши.
Ключевые слова: кливажная полиэмбриония, эмбриогенная ткань, соматические зародыши, лиственница сибирская.
В последнее десятилетие произошел значительный прогресс в области размножения древесных растений в культуре in vitro. Наиболее интересные результаты были получены при исследовании соматического эмбриогенеза - способа тиражирования, посредством которого достигается чрезвычайно высокая частота регенерации растений в культуре in vitro. По мнению Батыгиной (1994, 1999; Batygina, 2005), соматический эмбриогенез -это новая категория вегетативного размножения, которая приводит к формированию зародыша (эм-бриоида) из соматической клетки, формирующегося асексуально в условиях гомофазной репродукции в отсутствии мейоза и оплодотворения. В результате такого феномена из соматической клетки формируется соматический зародыш или эмбриоид (зародышеподобная структура), ведущий к образованию растения.
Соматический эмбриогенез является перспективной модельной системой для изучения закономерностей клеточной дифференцировки и реализации морфогенетической программы развития в процессе эмбриогенеза (Von Arnold et al., 2002).
Впервые процесс соматического эмбриогенеза был описан в культуре in vitro Daucus carota
1 Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (проект < 06-04-08040-офи), Красноярским краевым фондом науки (проект < 16G-074) и РФФИ-ККФН (проект < 07-04-96810-р_енисей_а).
(Steward et al., 1958; Reinert, 1958) и в дальнейшем был индуцирован у самых различных видов покрытосеменных растений (Батыгина, 1999; Von Arnold et al., 2002). У голосеменных растений соматический эмбриогенез был индуцирован значительно позже, при этом первым представителем, у которого он был получен, является Picea abies (Chalupa, 1985; Hakman et al., 1985). К настоящему времени регенерация растений посредством соматического эмбриогенеза у хвойных получена у 16 видов рода Pinus, у 11 видов рода Picea, у 4 видов и 2 гибридов рода Abies, у 6 видов и гибридов рода Larix, а также у Pseudotsuga menziesii (Klimaszews-ka, Cyr, 2002). В качестве источника соматических клеток для индукции соматического эмбриогенеза у хвойных используются мегагаметофиты, зрелые и незрелые зародыши и их отдельные органы (семядоли и гипокотиль), хвоя молодых растений (Lelu et al., 1994а), а также сегменты вегетативных побегов взрослых деревьев (Malabadi, Van Staden, 2005).
Несмотря на активные исследования по соматическому эмбриогенезу хвойных в последние годы, регенерация растений таким путем все еще остается проблематичной для ряда видов. Критическим моментом является успешность прохождения поздних стадий и получение полноценных зародышей, способных к прорастанию и продуцированию нормальных растений-регенерантов.
Исследования соматического эмбриогенеза у сибирских видов лиственниц до сих пор не проводились. Между тем лиственница сибирская является основным лесообразователем хвойных лесов Восточной Сибири. Ее древесина считается наиболее устойчивой к гниению, имеет высокую механическую прочность, и поэтому пользуется быстрорастущим спросом. Однако при выращивании на лесосеменных плантациях данный вид дает низкий урожай семян и к тому же сильно поражается лиственничной почковой галлицей (Баранчиков, 1995). Разработка современных биотехнологий, позволяющих получать быстрорастущие, высокопродуктивные, устойчивые к лиственничной почковой галлице деревья лиственницы сибирской, является весьма актуальной. Обычные методы селекции имеют в этом отношении ограниченные возможности. Применение эффективных инновационных технологий с использованием соматического эмбриогенеза в сочетании с криоконсерва-цией и генетико-селекционными методами даст возможность для получения, раннего отбора и испытания ценных генотипов, а также их быстрого распространения. Это будет способствовать массовому получению улучшенных высокопродуктивных клонов и чистых линий хвойных растений для клонального лесоводства (Rao, 1993; Park, 2002).
Цель настоящего исследования - разработка эффективных биотехнологических методов тиражирования различных генотипов лиственницы сибирской посредством соматического эмбриогенеза и их оптимизация на основе цитоэмбриологиче-ского контроля на каждом этапе эксперимента.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Объекты исследований. Объектом настоящих исследований являлись 40-летние деревья лиственницы сибирской (Larix sibirica Ledeb.), устойчивые к поражению лиственничной почковой галлицей, произрастающие в естественных насаждениях на территории Республики Хакасия и в искусственных насаждениях г. Красноярска.
Растительный материал. Семена, собранные с указанных деревьев, разделяли на две части, одну из которых использовали для цитоэмбриоло-гических исследований, а другую - для введения в культуру in vitro.
В качестве эксплантов для индукции соматического эмбриогенеза использовали мегагамето-фиты и изолированные зиготические зародыши на разных стадиях формирования, полученные в результате свободного опыления.
Мегагаметофиты извлекали из семян и стерилизовали гипохлоритом натрия или раствором йода с 90%-ным спиртом (1 : 3) с последующим трехкратным промыванием в стерильной дистиллированной воде. Зародыши извлекали из мегагаметофитов в
Таблица 1. Состав питательных сред для индукции и пролиферации эмбриогенной ткани из зиготических зародышей лиственницы! сибирской
Компоненты среды Концентрация веществ в среде, мг/л
индукционной пролиферационной
L-глютамин 1.45* 1.45*
Мезоинозит 0.1 0.1
Ауксин (2,4-D) 2 2
Цитокинин 1 0.5
(6-БАП)
Сахароза 30 х 103 15 х 103
Агар 7 х 103 -
Gelrite - 4 х 103
* Концентрация дана в г/л.
стерильных условиях и помещали на питательную среду по 10 шт. на стеклянную колбу.
Инокуляцию зародышей на питательную среду осуществляли на следующих четырех стадиях:
I - глобулярной (длина зародыша <1 мм, 1-я декада июля, фаза раннего эмбриогенеза);
II - инициации семядолей, апексов побега и корня (длина зародыша 2 мм, 2-я декада июля, фаза позднего эмбриогенеза);
III - сформированного зародыша (семядоли и другие органы полностью сформированы) (длина зародыша 2-3 мм, 3-я декада июля, 1-я декада августа, фаза позднего эмбриогенеза);
IV - зрелого зародыша (длина 3 мм, 3-я декада августа).
Среды для культивирования. Методика получения соматических зародышей у хвойных включает ряд последовательных стадий, требующих определенного состава сред и гормональных добавок: инициацию эмбриогеной ткани, пролиферацию ее клеток с образованием соматических зародышей и их созреванием. Эти стадии различаются по длительности и условиям культивирования.
Во всех экспериментах использовали основную среду MSG (Becwar et al., 1990) с добавлением 1.45 г/л L-глютамина и 0.1 г/л мезоинозита (Lelu et al., 1994b). В индукционной среде в качестве гормонов использовали 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д) и 6-бензиламинопурин (6-БАП) в концентрациях 2 и 1 мг/л для 2,4-Д и 6-БАП соответственно. В пролиферационной среде концентрация ауксинов оставалась без изменений, а концентрации цитокининов и сахарозы уменьшались в два раза; агар был заменен на gerlite (табл. 1).
Индукцию эмбриогенной ткани проводили в течение 1-2, а пролиферацию - 6 мес с регулярными пересадками через каждые 2 нед. Культуры выдерживали в темноте при температуре 24 ± 1°C.
Рис. 1. Два зародыша на глобулярной стадии развития в коррозийной полости женского гаметофита лиственницы сибирской, возникшие в результате оплодотворения двух яйцеклеток.
Цитологический анализ и статистическая обработка данных. Для проведения цитологического анализа использовали постоянные и давленые препараты. Приготовление постоянных препаратов проводили по стандартным методикам и окрашивали гематоксилином по Гайденгайну (Паушева, 1980). Для приготовления давленых препаратов экспланты помещали на предметное стекло и 1-2 мин выдерживали в красителе (сафранин с добавлением метиленового синего) (Паушева, 1980), далее добавляли глицерин и накрывали препарат покровным стеклом.
Просмотр препаратов осуществляли на микроскопе МБИ-6. Замеры клеток и эмбриональных структур проводили при помощи окуляр-микрометра с последующим переводом полученных единиц в мкм. Статистическую обработку данных проводили по стандартным методикам при помощи Microsoft Excel. Для оценки достоверности полученных данных использовали однофакторный дисперсионный анализ. Морфологические изменения фиксировали цифровой фотокамерой Fud-jifilm FinePix S7000 (Япония).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Эмбриогенез лиственницы сибирской in vivo. Развитие зародыша у лиственницы сибирской проходит аналогично другим видам лиственниц и состоит из трех последовательных (характерных для сем. Pinaceae в целом) фаз: проэмбриогенез, ранний эмбриогенез и поздний эмбриогенез. Проэмбриогенез включает стадии формирования проэм-брио,
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.