ВОДНАЯ ТОКСИКОЛОГИЯ
УДК 597.551.2-111.12:546.173
ОСОБЕННОСТИ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ СИСТЕМЫ ВОССТАНОВЛЕНИЯ МЕТГЕМОГЛОБИНА В ЭРИТРОЦИТАХ СТЕРЛЯДИ ПРИ НИТРИТНОЙ ИНТОКСИКАЦИИ © 2015 г. Л. В. Худая, А. И. Худый, М. М. Марченко
Черновицкий национальный университет им. Юрия Федьковича, 58012 г. Черновцы, ул. М. Коцюбинского, 2, Украина, e-mail: lidia_khuda@email.ua Поступила в редакцию 29.09.2013 г.
Исследовано содержание метгемоглобина и функциональное состояние системы его восстановления в эритроцитах стерляди Acipenser ruthenus L. при влиянии нитрита натрия в диапазоне концентраций 7.25—217.5 ммоль/л. Показано, что в основе специфики накопления метгемоглобина лежат функциональные особенности метгемоглобинредуктазной системы. Высокие концентрации нитритов в плазме ингибируют гемсодержащие ферменты (метгемоглобинредуктазу, каталазу), которые в норме предотвращают чрезмерное накопление метгемоглобина. В условиях нитритной интоксикации ведущая роль в функционировании системы восстановления метгемоглобина принадлежит ее неэнзиматическим компонентам (восстановленному глутатиону, аскорбату).
Ключевые слова: нитриты, метгемоглобин, эритроциты, Acipenser ruthenus L. DOI: 10.7868/S0320965215020084
ВВЕДЕНИЕ
Ценным объектом пресноводной аквакульту-ры как с природоохранной точки зрения, так и из-за высокой пищевой ценности считается стерлядь. В бассейне верхнего Днестра сохранилась одна из наиболее мощных туводных популяций стерляди в Украине, что обусловливает необходимость ее искусственного воспроизводства и подращивания с последующим зарыблением природных водоемов. Особого внимания в данном аспекте заслуживают современные интенсивные технологии рыбоводства, в частности применение установок замкнутого водоснабжения (УЗВ). Рециркуляция воды обеспечивает более высокое, быстрое и стабильное производство продукции с меньшим риском возникновения болезней, независимость производственного процесса от природно-климатических условий, его непрерывность, а также возможность контроля основных параметров водной среды, влияющих на рыбопродуктивность.
Среди основных факторов качества воды при использовании подобных технологий особого внимания и постоянного мониторинга требуют азотные показатели. Поступление соединений азота в водную среду обусловлено жизнедеятельностью самих объектов аквакультуры, поскольку у рыб аммоний — основной продукт белкового
метаболизма. Кроме того, интенсивное выращивание рыбы в УЗВ происходит при использовании высокобелковых кормов, которые служат дополнительными источниками азота в воде.
Аммоний выделяется из водной среды благодаря конверсии в нитриты и в дальнейшем в нитраты, что осуществляется нитрифицирующими бактериями в биофильтре УЗВ. Повышенная плотность посадки рыб даже при незначительной нехватке кислорода может привести к возможности накопления нитритов в воде и интоксикации [16, 18].
Основное проявление токсического действия нитритов — усиленное формирование в эритроцитах метгемоглобина (МШЬ) и развитие гемиче-ской гипоксии. У рыб уровень метгемоглобина может варьировать в широких пределах за счет эффективного функционирования многокомпонентной системы его восстановления [7]. Восстановление метгемоглобина в эритроцитах осуществляется при участии двух ферментных систем, одна из которых связана с гликолизом (фермент МЛОИ-метгемоглобинредуктаза), другая — с пен-тозофосфатным путем (фермент МЛЭРИ-метге-моглобинредуктаза). При физиологических условиях 70—90% метгемоглобина трансформируется в гемоглобин с участием МЛЭИ-зависимой метге-моглобинредуктазы (МЛЭИ-цитохром Ь5-редук-
99
7*
таза, КФ 1.6.2.2.), который выполняет роль специфического переносчика электронов от МЛВИ через цитохром Ь5 на МШЬ. Роль резервной энзи-матической системы превращения метгемогло-бина в гемоглобин выполняет МЛЭРИ-метгемо-глобинредуктаза, физиологически более инертный фермент, который может активироваться экзогенными акцепторами электронов, например метиленовым синим или рибофлавином. Кроме указанных энзиматических путей редукции метгемоглобина существует возможность прямого его восстановления эндогенными низкомолекулярными соединениями — восстановленным глутатионом и аскорбиновой кислотой [6, 15, 17]. Поскольку в эритроцитах наблюдается тесное переплетение путей утилизации активных форм кислорода и функционирования метгемо-глобинредуктазной системы, целесообразно исследование активности каталазы — гемсодержа-щего фермента антиоксидантой системы, функционирование которого в физиологических условиях предохраняет гемоглобин от чрезмерного окисления.
Цель работы — определить влияние нитритной интоксикации на содержание метгемоглобина и функционирование системы его восстановления в эритроцитах стерляди Ларвтвг гыЛвпш Ь.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Для моделирования нитритного влияния на функционирование системы восстановления метгемоглобина использованы изолированные эритроциты годовиков стерляди средней массой 350 г. Пробы крови отбирали из спинной аорты с использованием в качестве антикоагулянта гепарина. Эритроциты отделяли от плазмы центрифугированием при 500 % и трижды промывали в растворе Рингера. Отделенные эритроциты распределяли на шесть групп: контрольную и пять опытных, которых подвергали 30-минутному инкубированию при температуре 20°С в растворе Рингера, содержащем следующие концентрации №N0* ммоль/л: 7.25 (I группа), 14.5 (II), 72.5 (III), 145.0 (IV) и 217.5 (V).
Полулетальная доза нитрит-ионов в воде для целого ряда видов пресноводных рыб составляет 1.45 ммоль/л [10, 18]. Учитывая, что для рыб характерна десятикратная аккумуляция нитрит-иона в плазме крови [13], концентрации нитрит-ионов в среде инкубирования эритроцитов были соответственно увеличены.
Содержание метгемоглобина (% общего гемоглобина) оценивали спектрофотометрически аце-тон-циангидриновым методом [2]. Удельную активность метгемоглобинредуктазы (мкмоль/мин
на 1 мг гемоглобина) определяли по скорости восстановления метгемоглобина в присутствии NADH [2]. Удельную активность каталазы (ммоль/мин на 1 мг белка) оценивали по скорости утилизации пероксида водорода в реакции с молибдатом аммония [5]. Содержание восстановленного глутатиона (ммоль на 1 мг белка) определяли в реакции с 5,5-дитио-бис-(2-нитробензой-ной) кислотой [5], восстановленной аскорбиновой кислоты (мкмоль на 1 мг гемоглобина) — по разнице между содержанием всех форм аскорбата и суммы дегидроаскорбиновой и дикетогулоновой кислот [2]. Содержание общего белка (мг/мл) определяли методом Лоури, гемоглобина (НЬ, мг/мл) — гемоглобинцианидным методом [4].
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Повышенное содержание метгемоглобина отмечали в эритроцитах всех опытных групп. Однако наиболее существенное накопление МШЬ происходило в эритроцитах, инкубируемых при концентрациях нитритов, близких к полулетальным (II и III опытные группы) — его доля составляла ~50% общего гемоглобина (см. рисунок, а). Использование более высоких концентраций нитритов (145 и 217.5 ммоль/л) сопровождалось снижением содержания метгемоглобина, показатели которого, однако, превышали контрольные значения в 2.6 и 2.8 раза соответственно.
При исследовании уровня метгемоглобинре-дуктазной активности установлено, что инкубация эритроцитов с нитритами в концентрациях до 145 ммоль/л не приводит к достоверным изменением данного показателя — активность неизменно остается на уровне контроля (см. рисунок, б). В четвертой опытной группе регистрировали снижение уровня метгемоглобинредуктазной активности в 1.4 раза по сравнению с контролем.
Активность еще одного гемсодержащего фермента эритроцитов (каталазы) понижена при всех исследуемых концентрациях нитритов, причем минимальные показатели активности наблюдались в эритроцитах I и III опытных групп (см. рисунок, в).
Среди компонентов неферментативного звена системы восстановления метгемоглобина изучено содержание восстановленного глутатиона и аскорбиновой кислоты. Оба показателя достаточно динамично реагируют на воздействие нитритов, отличаясь при этом от контрольных значений фактически во всех вариантах опыта. Понижение уровня восстановленного глутатиона в эритроцитах III и IV групп (на 42 и 58% соответственно) указывает на его активное участие в восстановлении метгемоглоби-на при действии NaN02 в концентрации 72.5 и 145 ммоль/л (см. рисунок, г). Инкубация эритроци-
% 60
40
20
* *
]_|_ | _ | _ | _ | _1_1
ммоль/мин на 1 мг белка 1.2
0.6
1_1_ | _ | _ | _ | _ы
мкмоль на 1 мг ИЬ 0.45
0.30
0.15
мкмоль/мин на 1 мг ИЬ 2
J_l_ | _1_1
ммоль на 1 мг белка 0.4
0.2
К 7.25 14.5 72.5 145.0 217.5
ммоль/л
К 7.25 14.5 72.5 145.0 217.5
ммоль/л
Метгемоглобин (а), удельные метгемоглобинредуктазная (б) и каталазная (в) активности, восстановленные глута-тион (г) и аскорбат (д) в эритроцитах стерляди при действии различных концентраций NN02, ммоль/л: К — контроль; "*" — различия по сравнению с контролем достоверны.
тов стерляди с нитритами в меньших концентрациях (две первые опытные группы) сопровождалась увеличением содержания GSH по сравнению с контролем.
Прослеживалась четкая динамика уменьшения содержания восстановленного аскорбата в эритроцитах при увеличении концентрации нит-
ритов в среде инкубирования (см. рисунок, д). Существенное уменьшение показателя наблюдали уже в эритроцитах I группы (в ~1.5 раза по сравнению с контрольной группой), минимальные значения уровня аскорбиновой кислоты отмечено при использовании №N02 в концентрации 217.5 ммоль/л.
а
*
*
*
1
*
в
г
*
*
*
*
д
*
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Гемоглобин рыб малоустойчив к окислению, поэтому даже в физиологических условиях уровень МШЬ у них может варьировать в широких пределах. Отсутствие при этом видимых признаков интоксикации объясняется эффективным функционированием многокомпонентной метге-моглобинредуктазной системы [1, 7].
В основе установленной специфики накопления метгемоглобина в эритроцитах стерляди при нитритном влиянии могут находиться функциональные особенности системы, направленной на восстановление МШЬ. Главным компонентом, в норме обеспечивающим восстановление МШЬ в гемоглобин у всех позвоночных
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.