= БИОХИМИЯ =
УДК 577.152.1:595.7
ОСОБЕННОСТИ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ СУКЦИНАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ ИЗ ЛЕТАТЕЛЬНЫХ МЫШЦ Bombus terrestris (L.)
© 2013 г. Т. М. Горбачева, М. Ю. Сыромятников, В. Н. Попов, А. В. Лопатин, А. Т. Епринцев, Д. Н. Федорин
Воронежский государственный университет, 394006Воронеж, Университетская пл., 1 E-mail: soki-tanya@yandex.ru Поступила в редакцию 22.06.2011 г.
Обнаружено повышение скорости окисления сукцината в 2.15 раза в митохондриях Bombus terrestris L. после полета в течение 1 ч. Из летательных мышц B. terrestris получен электрофоретически гомогенный препарат сукцинатдегидрогеназы с удельной активностью 7.14 Е/мг белка и степенью очистки 81.55 раза. Показано, что данный фермент представлен в мышечной ткани одной изоформой, Rf = = 0.24. Определены молекулярные массы нативной молекулы, субъединиц А и В, а также исследованы кинетические характеристики сукцинатдегидрогеназы (Км = 0.33 мМ), установлено оптимальное значение концентрации ионов водорода (pH 7.8) и влияние солей на активность фермента. Обсуждаются роль сукцината в качестве субстрата дыхания в стрессовых условиях, особенности строения и функционирования сукцинатдегидрогеназной системы в летательных мышцах насекомых.
DOI: 10.7868/S0002332913050056
Насекомые по сравнению с другими животными характеризуются самым высоким уровнем метаболизма в соотношении к весу тела. Скорость переноса электронов между компонентами электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) в митохондриях летательных мышц насекомых выше, чем у других организмов, а скорость продукции аденозинтри-фосфата (АТФ) в 3 раза выше, чем в мышцах колибри, и в 30 раз выше, чем в мышцах легкоатлета (Suarez et al, 1996, 2005). Как известно, 2—5% потребляемого кислорода расходуется на образование активных форм кислорода (АФК) (Harman, 2006). При усиленном поступлении кислорода в клетки или нарушении работы ЭТЦ митохондрий образование АФК может значительно возрастать (Starkov, 2008; Murphy, 2009). Высокая интенсивность дыхания насекомых обусловлена не количеством ферментов, а их высокой удельной активностью (Suarez, 2000). Кроме того, в летательных мышцах насекомых цикл Кребса характеризуется большей интенсивностью по сравнению с таковым у других животных (Гилмур, 1968), что достигается высокой активностью ряда катаболических ферментов.
Основные субстраты дыхания у насекомых — пролин, пируват, а-глицерофосфат. Характерной чертой летательных мышц является то, что мито-хондриальная и цитоплазматическая формы фермента а-глицерофосфатдегидрогеназы (а-ГФДГ) образуют мощный каталитический цикл, передающий электроны на ЭТЦ (Suarez et al., 2005; Car-mon, MacIntyre, 2010). Функционирование
а-ГФДГ хорошо изучено в организмах разных таксономических групп, в том числе насекомых (Agboola et al., 2003; Miwa, Brand, 2005; Yeh et al., 2008; Carmon, MacIntyre, 2010; Orr et al., 2012; MraСek et al., 2013). Известно, что сукцинат является субстратом дыхания в стрессовых условиях (Кондрашева и др., 1987; Zakharchenko et al., 2013). Более того, сукцинат — компонент множества метаболических реакций, что позволяет ему осуществлять гибкий контроль соотношения метаболических потоков, т.е. играть роль регуляторно-го фактора. Изучение роли окисления сукцината заслуживает более пристального внимания. Реакция превращения сукцината в фумарат с образованием энергетического эквивалента в виде восстановленного флавинадениндинуклеотида (ФАДН2) катализируется сукцинатдегидрогеназой (СДГ).
СДГ представляет собой мультифункциональ-ный фермент. Данный энзим участвует в цикле Кребса, катализируя реакцию окисления сукци-ната, и одновременно является компонентом комплекса II дыхательной цепи митохондрий. В настоящее время принято называть растворимой СДГ фермент, обладающий сукцинат-феррициа-нидредуктазной или сукцинат-феназинметасуль-фатредуктазной активностью (КФ 1.3.99.1.), а сук-цинат-убихинонредуктазой (СУР) — комплекс, в качестве акцептора электронов использующий уби-хинон (КФ 1.3.5.1.) (Виноградов, 1986).
Сегодня достоверно установлено, что в состав комплекса II входят два домена: большой растворимый, состоящий из субъединицы А (флавопро-
теин, ~600 аминокислот, ковалентно связывающий ФАД) и субъединицы В (~250 аминокислот, содержит железосерные кластеры трех видов: один двухъядерный (2Fe : 2S), один трехъядерный (3Fe : 3S) и один четырехъядерный (4Fe : 4S)), и гидрофобный, состоящий из двух мембранных субъединиц (Lenaz, Genova, 2010; Rutter et al., 2010; Iverson, 2012).
Выделение и изучение свойств СДГ сопряжено с рядом трудностей, так как в процессе очистки, отделяясь от мембранных компонентов, фермент становится крайне лабильной структурой. Впервые очищенный препарат растворимой СДГ был получен из животных тканей Сингером (Singer, Kearney, 1954). В литературе описано несколько способов выделения комплекса II из митохондрий животных тканей, микроорганизмов (Moll, Schafer, 1991; Yu, Yu, 1993) и растений (Игамбердиев, Фалалеева, 1994). Однако выделения данного фермента из летательных мышц насекомых, в частности B. terrestris, не проводилось.
Цель работы — эффективный способ получения ферментативного препарата СДГ в гомогенном состоянии из мышечной ткани шмелей и исследование физико-химических, основных каталитических и некоторых регуляторных свойства энзима.
Нам не известно ни одной работы, в которой бы комплексно изучался данный фермент в насекомых. Структурная организация молекулы СДГ устроена таким образом, что данный белок расположен вблизи источников генерации АФК — компонентов ЭТЦ. В связи с этим важно и актуально изучить и охарактеризовать особенности организации окисления сукцината в митохондриях летательных мышц Bombus terrestris L. и функционирования СДГ, ее молекулярную структуру и регу-ляторные свойства.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектом изучения служили самцы земляного шмеля B. terrestris (Hymenoptera, Apoidea, Apidae), извлеченные из садков с крупными лабораторными колониями. Митохондрии выделяли дифференциальным центрифугированием (Северин, Соловьева, 1989). Тораксы измельчали ножницами и гомогенезировали в среде выделения (в соотношении 1 : 7) следующего состава: 220 мМ маннитол, 100 мМ сахароза, 1 мМ этиленгликоль-тетрауксусная кислота (ЭГТА), 2 мг/мл бычий сывороточный альбумин (БСА), свободный от жирных кислот, 20 мМ 4-(2-оксиэтил)-1-пиперазинэтансуль-фоновая кислота (Hepes), pH 7.3. Все процедуры проводили при температуре не выше 4°С.
Скорость поглощения кислорода митохондриями регистрировали полярографически с использованием кислородного электрода типа Кларка
(Hansatech Instruments, США). Все эксперименты проводили при 24°С в 1 мл среды инкубации, содержавшей 220 мМ маннитол, 100 мМ сахарозы, 1 мМ ЭГТА, 4 мМ KH2PO4, 20 мМ Hepes, pH 7.3, и 10 мМ сукцината натрия. Все измерения выполнялись в течение 1.5 ч после выделения митохондрий.
Активность СДГ измеряли спектрофотомет-рически на СФ-2000 (ЛОМО, Россия) при длине волны 600 нм. Для этого использовали метод, основанный на применении искусственных акцепторов электронов (Cooper, Gutman, 1976). Активность СДГ определяли в среде, состоявшей из 0.1 М натрий-фосфатного буфера, рН 7.8, 50 мМ сукцината натрия, 3 мМ феназинметасульфата (ФМС), 0.002%-ного дихлорфенолиндофенола (ДХФИФ), 5 мМ NaN3. За единицу ферментативной активности (Е) принимали количество фермента, восстанавливающего 1 мкМ ДХФИФ за 1 мин при 25°С. Общее количество белка определяли методом Лоури (Lowry et al., 1951).
Очистку фермента проводили с использованием модифицированной четырехстадийной схемы (Кочетов, 1980):
стадия 1 — гомогенизация и выделение митохондрий, осадок, содержавший в основном митохондрии и микротельца, ресуспендировали в 1 мл среды (0.1 М натрий-фосфатный буфер, рН 7.8, 0.01% Triton Х-100 (конечная концентрация в 1 мл), 20 мМ сукцината натрия);
стадия 2 — фракционирование сульфатом аммония;
стадия 3 — обессоливание препарата белка гель-фильтрацией на колонке с сефадексом G-25 (1.7 х 15 см) (Pharmacia, Швеция), уравновешенной 0.1 М натрий-фосфатным буфером, рН 7.8;
стадия 4 — ионообменная хроматография на диэтиламиноэтил (DEAE)-Toyopearl (1.8 х 20 см) (Toyosoda, Япония), элюцию осуществляли линейным градиентом KCl (50—250 мМ).
Электрофоретические исследования проводили модифицированным методом Дэвиса в 8%-ном разделительном полиакриламидном геле (ПААГ) (Davis, 1964). Растворы готовили методом Мауэра (Мауэр, 1971).
Денатурирующий электрофорез в ПААГ с до-децилсульфатом натрия (Ds-Na-ПААГ) осуществляли при концентрации геля 12.5% методом Лэммли (Laemmly, 1970). Для построения калибровочной кривой использовали смесь стандартных маркерных белков с молекулярной массой 10—200 кДа (Fermentas, Литва).
Универсальное окрашивание белков в геле осуществляли с использованием нитрата серебра (Shevchenko et al., 1996). Для специфического проявления применяли тетразолиевый метод со средой следующего состава: 0.1 М натрий-фос-
Очистка сукцинатдегидрогеназы из B. terrestris
Стадия очистки Объем, мл Количество Общая Удельная активность, Е/мг белка Выход, Степень
белка, мг активность, Е % очистки
Гомогенат 5.5 59.14 ± 0.2 5.18 ± 0.04 0.09 ± 0.02 100 1
Митохондриальная фракция 2.2 14.04 ± 0.06 8.2 ± 0.03 0.58 ± 0.05 158 6.67
Фракционирование (NH4)2SO4, 15-45% 2.2 10.04 ± 0.02 3.1 ± 0.04 0.31 ± 0.03 59.85 3.45
Гель-фильтрация на сефадексе G-25 2 8.1 ± 0.05 2.85 ± 0.02 0.35 ± 0.02 55.02 4.02
Хроматография на DEAE-Toyopearl 2 0.15 ± 0.01 1.1 ± 0.03 7.14 ± 0.32 21.24 81.55
фатный буфер (рН 7.8), 0.1 М сукцината натрия, 0.5 мг/мл нитросинего тетразолия, 1 мг/мл ФМС (Северин, Соловьева, 1989). Гели хранили в 7%-ном растворе уксусной кислоты.
Молекулярную массу нативной СДГ определяли гель-хроматографией на Тоуореаг1 HW-65 (Тоуо8оёа) с использованием маркерных белков: каталазы (120 кДа), БСА (66.2 кДа), яичного альбумина (45 кДа) и пероксидазы (45 кДа). Кинетические и регуляторные свойства фермента изучали на электрофоретически гомогенных препаратах СДГ. Константу Михаэлиса (Км) рассчитывали методом двойных обратных координат (1/у и 1/^) по графику Лайнуивера—Берка с использован
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.