БИОХИМИЯ, 2015, том 80, вып. 2, с. 224 - 248
УДК 571.27;577.151
ОСОБЕННОСТИ ГИДРОЛИЗА АНТИТЕЛАМИ ПРОТИВ ВИРУСНОЙ ИНТЕГРАЗЫ ИЗ КРОВИ
ВИЧ-ИНФИЦИРОВАННЫХ БОЛЬНЫХ СПЕЦИФИЧЕСКИХ И НЕСПЕЦИФИЧЕСКИХ ГЛОБУЛЯРНЫХ БЕЛКОВ И ОЛИГОПЕПТИДОВ*
© 2015 Е.С. Одинцова1, П.С. Дмитренок2, С.В. Баранова1, А.М. Тимофеева1, В.Н. Бунева13, Г.А. Невинский13**
1 Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, 630090Новосибирск; факс: +7(383)33-3677, электронная почта: nevinsky@niboch.nsc.ru
2 Тихоокеанский институт биоорганической химии ДО РАН, 690022 Владивосток
3 Новосибирский государственный университет, 630090 Новосибирск; факс: +7(383)330-3255, электронная почта: nsu@nsu.ru
Поступила в редакцию 30.06.14 После доработки 18.09.14
Ранее было показано, что в отличие от канонических протеаз абзимы против основного белка миелина (ОБМ) из крови пациентов с рассеянным склерозом и системной красной волчанкой (СКВ) эффективно расщепляют только ОБМ, а антитела (АТ) против интегразы (ИН) из крови ВИЧ-инфицированных больных специфически гидролизуют только ИН. В данной работе все сайты эффективного гидролиза 25-звен-ного олигопептида (ОП25), соответствующего ОБМ, анти-ИН антителами (^в и ]&М) были идентифицированы сочетанием методов обращенно-фазовой и тонкослойной хроматографий, а также масс-спектро-метрии. Показано, что последовательности ОР25 и других неспецифических олигопептидов (ОП), расщепляемых анти-ОБМ абзимами, частично гомологичны нескольким фрагментам полной последовательности ИН. Последовательности олигопептидов ИН, расщепляемые анти-ИН абзимами, гомологичны нескольким фрагментам ОБМ, но анти-ОБМ абзимы не способны эффективно гидролизовать ОП, соответствующие ИН. Выявлены общие черты сайтов расщепления ОП25 и других ОП анти-ОБМ и анти-ИН абзимами. Проведен анализ литературных данных по гидролизу специфических и неспецифических белков и олигопептидов абзимами против разных белков-антигенов. Совокупность этих данных свидетельствует о том, что короткие ОП, включая ОП25, взаимодействуют в основном с легкими цепями поликлональных АТ, которые обладают низкими сродством и специфичностью по отношению к субстрату по сравнению с интактными АТ Однако анти-ИН АТ в настоящее время, по-видимому, являются единственным примером абзимов, способных высокоэффективно (в течение нескольких часов, а не суток) гидролизовать самые разные оли-гопептиды. Обсуждаются возможные причины эффективного гидролиза чужеродных олигопептидов анти-ИН абзимами ВИЧ-инфицированных больных.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: ВИЧ-инфицированные больные, каталитические антитела против вирусной интегразы, интеграза, основной белок миелина, гидролиз пептидов основного белка миелина.
В последние годы в литературе достаточно подробно описаны искусственные каталитически активные антитела (абзимы) против переходных состояний различных химических реакций
(ссылки в [1]), в частности, природные абзимы, гидролизующие ДНК, РНК, полисахариды, олиго-пептиды (ОП) и белки из крови пациентов с различными аутоиммунными заболеваниями (АИЗ)
Принятые сокращения: АИЗ — аутоиммунное заболевание; АК — аминокислота; АТ — антитела; ВИЧ — вирус иммунодефицита человека; ИН — интеграза ВИЧ; ИАП — иммуногенная аминокислотная последовательность; МКА — 4-ме-тилкумарил-7-амин; ОБМ — основной белок миелина; ОП — олигопептид; ОФХ — обращенно-фазовая хроматография; IgGmix и IgMmix — смеси индивидуальных антител из крови ВИЧ-инфицированных больных; СКВ — системная красная волчанка; РС — рассеянный склероз; Х — флуоресцентный остаток 6-О-(карбоксиметил)флуоресцеин этиловый эфир; ЧСА — человеческий сывороточный альбумин.
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 14-187, 25.01.2015.
** Адресат для корреспонденции.
(системная красная волчанка (СКВ), тиреоидит Хашимото, полиартрит, рассеянный склероз (РС), астма, ревматоидный артрит и др.) и некоторыми вирусными инфекциями, которые сопровождаются нарушением иммунного статуса (гепатиты, ВИЧ-инфекция, клещевой энцефалит) (ссылки в [2—6]). У здоровых доноров и больных многими другими заболеваниями с незначительными аутоиммунными реакциями накопления абзимов не наблюдается, образуются антитела (АТ) с низкими каталитическими активностями, которые невозможно достоверно детектировать с помощью существующих методов [2—6]. Кроме классических функций АТ, аб-зимы могут играть как положительную, так и отрицательную роль, вызывая специфические процессы и клинические проявления при различных аутоиммунных состояниях, включая ВИЧ-инфекцию [2—6].
ВИЧ-1 является этиологическим агентом чрезвычайно опасного заболевания человека — СПИД [7]. Цикл репликации ВИЧ-1 включает процесс обратной транскрипции вирусной РНК с последующей интеграцией образующейся ДНК в хозяйский геном [8]. Обратную транскрипцию катализирует ретровирусная РНК-зависимая ДНК-полимераза (обратная транскриптаза, ОТ) [9, 10]. Репликация ретровирусов зависит от эффективности процесса интеграции двухцепо-чечной ДНК ретровирусного генома в ядерный геном клетки хозяина [8]. Стадия интеграции катализируется вирусным ферментом интегра-зой (ИН) [11]. ИН и ОТ являются важнейшими «мишенями» для подавления развития ВИЧ.
Кровь ВИЧ-инфицированных больных содержит АТ ко многим различным как вирусным белкам (ОТ и ИН), так и белкам человека [5, 12, 13]. В первом сообщении о том, что кровь ВИЧ-инфицированных больных содержит ДНК-гид-ролизующие АТ не было приведено доказательства, а именно, проверки известных жестких критериев отнесения активности непосредственно иммуноглобулинам [14]. Позже был проведен детальный анализ и показано, что ДНКазная активность действительно является собственным свойством антител ВИЧ-инфицированных больных [15]. Недавно было показано, что препараты ^О и ^М из крови ВИЧ-инфицированных пациентов после аффинной хроматографии на сорбентах с иммобилизованными ОТ, ИН, ЧСА и казеином гидролизуют только соответствующий субстрат, но не другие белки [16—20]. Длительная инкубация ИН с ^О-или ^М-абзимами, обладающими высокой протеолитической активностью, приводит к образованию большого числа пептидов различной длины, включая короткие ОП [19]. Сорок сай-
тов расщепления ИН абзимами ВИЧ-инфицированных больных, определенные MALDI масс-спектрометрией, локализованы в основном в семи известных иммунодоминантных последовательностях ИН [19]. Два 20-звенных ОП, соответствующих иммуногенным последовательностям ИН, содержали 9—10 кластеризованных мажорных, умеренных и минорных сайтов расщепления [19, 20]. Показано, что в общем пуле ^О и ^М крови ВИЧ-инфицированных больных только специфические анти-ИН АТ способны гидролизовать интактные глобулярные молекулы вирусной интегразы.
Рассеянный склероз — это хроническое аутоиммунное демиелинизирующее заболевание центральной нервной системы, ведущее к различным нервным и психиатрическим нарушениям [21]. Его этиология остается неясной, и признанной теорией патогенеза РС основная роль в разрушении миелина отводится воспалению, связанному с аутоиммунными реакциями [21]. Последние исследования показали, что в патогенезе РС важную роль играют В-клетки и ауто-АТ против аутоантигенов миелина, включая основной белок миелина (ОБМ) [21—23]. Недавно показано, что ОБМ-гидролизующая активность является собственным свойством препаратов ^О, ^М и IgA из крови пациентов с РС [24—26], и определены специфические сайты расщепления абзимами ОБМ [27].
Полиэтиологический и полисиндромный характер аутоиммунного диффузного заболевания системной красной волчанкой приводит к разнообразным проявлениям этой патологии с различными биохимическими, иммунологическими и клиническими параметрами [28]. Интересно, что СКВ и РС демонстрируют некоторое подобие медицинских, биохимических и иммунологических характеристик развития этих заболеваний. Например, у 50% пациентов с СКВ развиваются нейропсихиатрические расстройства, которые ведут к негативному прогнозу (ссылки в [21]). СКВ, возможно, в большей степени, чем какое-либо другое системное воспалительное заболевание, преимущественно затрагивает центральную нервную систему и мозг, вызывая психические расстройства [21]. Наработка разнообразных ауто-АТ, возможно, связана с дефектным функционированием апоптоти-ческих клеток.
АТ-опосредованное разрушение нервных клеток и реологические нарушения позволяют предположить два принципиальных механизма повреждения тканей [21]. Взаимодействие между этими процессами, основными наследственными факторами, их модификация гормонами, а также осложнение многими вторичными фак-
торами может объяснить широкий спектр особенностей развития РС и СКВ. Для СКВ и РС выявлено несколько общих, характерных для обеих патологий, параметров, включая появление бляшек в мозге [21].
Как недавно показано, титры АТ против основного белка миелина у пациентов с СКВ в 4,2 раза выше, чем у здоровых доноров, но в 2,1 раза ниже, чем у больных с РС [4]. При этом абзи-мы крови пациентов с СКВ и РС обладали одинаковыми каталитическими активностями. Показано, что IgG и/или IgM при СКВ и РС эффективно гидролизуют ДНК, РНК и полисахариды [1—4], а также ОБМ [24—27]. Электрофо-ретически и иммунологически гомогенные препараты IgG из крови больных СКВ и РС после аффинной хроматографии на сефарозе с иммобилизованным ОБМ (ОБМ-сефароза) специфически гидролизовали только ОБМ, а не другие тестируемые белки [29]. Показано, что анти-ОБМ-абзимы крови больных СКВ и РС гидро-лизуют ОБМ по одним и тем же сайтам [27, 30-34]. При СКВ и РС анти-ОБМ абзимы могут атаковать ОБМ миелино-протеолипидной оболочке аксонов. Показано, что стандартное лекарство при РС — копаксон (Copaxone) является специфическим ингибитором ОБМ-гидролизу-ющей активности абзимов [27]. Следовательно, ОБМ-гидролизующие абзимы могут играть важную негативную роль в патогенезе РС и СКВ.
Ранее было показано, что анти-ИН-абзимы ВИЧ-инфицированных больных эффективно гидролизуют двадцатиодномерный олигопеп-тид, соответствующий одной из четырех имму-ногенных последовательностей ОБМ [33]. Оставалось не ясным, является ли это случайным феномен
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.