РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2007, том 1(10), № 2, с. 116-131
ОБЗОР
ОСОБЕННОСТИ ГИДРОЛИЗА ДНК АНТИТЕЛАМИ ИЗ КРОВИ ПАЦИЕНТОВ С САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ
© 2007 г. А.В. Гальвита, А.Г. Барановский, И.А. Кузнецова, Н.В. Виншу*, В.А. Галенок*, В.Н. Бунева, Г.А. Невинский*
Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук, Новосибирск, Россия;
* Новосибирская государственная медицинская академия, Новосибирск, Россия
Поступила: 30.01.06 г. Принята: 02.04.07 г.
Впервые проведен анализ ДНК-гидролизующей активности IgG антител (АТ) из крови больных с первой (СД-1) и второй (СД-2) формами сахарного диабета (СД). Электрофоре-тически гомогенные препараты поликлональных АТ получены хроматографией белков плазмы крови (после удаления иммунных комплексов) на Sepharose с последую-
щей высокоэффективной гель-фильтрацией. В связи с использованием при этих хромато-графиях кислых буферов (рН 2,6), сразу после очитки АТ теряли свою активность, и она медленно восстанавливалась после их диализа против нейтрального буфера (рН 7,5), стерилизовали фильтрацией и хранения растворов при +4°С в течение 1 — 10 месяцев в нейтральном буфере, содержащем азид натрия. После 3-х недель хранения АТ высокая активность H2L2 олигомерных форм IgG обнаружена только у двух из 20 препаратов АТ от больных СД-1, в то время как 20 препаратов от пациентов с СД-2 проявляли слабую активность, а АТ здоровых доноров с заметной скоростью ДНК не гидролизовали. Показано, что хранение препаратов АТ в течение 6—10 месяцев приводит к заметной самодеградации IgG с образованием фрагментов тяжелой цепи и накоплению свободных легких цепей. Это ведет к повышению ДнКазной активности АТ в большей степени от больных СД-1, чем СД-2 и иногда появляется тестируемая активность у АТ от клинически здоровых доноров. Каталитически активные недеградированные олигомеры двух препаратов IgG были цитотоксичными, в то время как недеградированные олигомеры других препаратов АТ больных СД и здоровых доноров практически не влияли на рост опухолевых клеток-мишеней. Уровень цитотоксичности деградированных препаратов АТ от больных СД-2 и особенно СД-1 был существенно выше, чем от здоровых доноров и наблюдалась корреляция цитотоксичности с относительной ДНКазной активностью. В работе обсуждаются возможные причины самодеградации поликлональных IgG при хранении и повышения ферментативной активности, а также цитотоксичности деградированных форм АТ по сравнению с полноразмерными олигомерными формами иммуноглобулинов.
Ключевые слова: сахарный диабет, иммуноглобулины, природные абзимы, гидролиз ДНК
ВВЕДЕНИЕ
К настоящему времени известно более 100 различных реакций, катализируемых антителами (АТ), полученными на стабильные аналоги переходных состояний химических реакций (для обзора см. [1 — 6]).
Известно, что при аутоиммунных заболеваниях (АИЗ) происходит спонтанная нара-
ботка первичных АТ к белкам, ДНК и их комплексам, а затем вторичных АТ к первичным АТ и т.д. [7, 8]. Поэтому считается, что в крови пациентов с АИЗ могут содержаться различные АТ, которые могут быть как АТ непосредственно к антигену с измененной конформацией, так и антиидиотипическими АТ, возникновение которых можно объяснить на базе модели антиидиотипической сети Эрне [9].
Известно, что кровь больных некоторыми АИЗ содержит ДНК, а также анти-ДНК АТ в повышенных концентрациях [10—11], которые, как считается, появляются в результате
Адрес: 630090 Новосибирск, ул. Лаврентьева, 8, Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН. E-mail: nevinsky@niboch.nsc.ru
апоптоза клеток. Апоптотические клеточные антигены все больше и больше распознаются как мишени ауто-АТ [10—13].
Наличие в крови пациентов абзимов является четким признаком протекания в организме человека аутоиммунных процессов [10—13]. Природные абзимы с фосфатазной, ДНКазной, РНКазной [14 — 25], протеолити-ческой [26 — 27] и амилолитической [28] активностями обнаружены у больных с различными АИЗ (бронхиальная астма [26 — 27], СКВ [14 — 22], аутоиммунный тиреоидит [21], полиартрит [21], РС [23 — 24]), а также некоторыми вирусными (гепатит [25], СПИД [11]) заболеваниями (для обзора см. [10—13]). В период беременности и лактации женщины подвергаются внешней и скрытой внутренней иммунизации, что ведет к наработке абзимов [29]. IgG и sIgA молока человека катализируют реакции отщепления 5'-концевого фосфата ДНК, гидролиза ДНК, РНК [30-34], полисахаридов [35-36] рибо- и дезоксирибо^МР, NDP и №ТР [37], а также фосфорилирование белков [38-40] и липидов [41-42]. Абзимы молока человека обычно характеризуются более высокой активностью по сравнению с большинством известных абзимов больных АИЗ [10-13]. При этом следует отметить, что абзимы не обнаружены у здоровых людей и больных различными заболеваниями [10-13], протекающими без сильных нарушений иммунного статуса.
При недостаточной секреции инсулина или его неадекватном действии на соответствующие мишени развивается сахарный диабет (СД). СД по своей распространенности следует непосредственно после сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний, его частота составляет 5-7% и в настоящее время на земном шаре СД страдает около 130 млн. человек [43-44]. СД рассматривается как синдром хронической гипергликемии, развивающейся вследствие абсолютного или относительного дефицита инсулина и проявляющегося глюкозурией, полиурией, полиденсией, нарушением липидного, белкового и минерального обменов с развитием хронических и острых осложнений. Традиционно выделяют два типа сахарного диабета: инсулин-зависимый (тип 1) и инсулиннезависимый (тип 2), различаемых по патогенетическим механизмам. К причинам СД-1 относят вирусное поражение поджелудочной железы, образование ауто-АТ к инсулину и генетический дефект системы синтеза этого гормона (СД-1 часто называют аутоиммунным заболевани-
ем). СД-2 чаще всего развивается у тучных людей. К его признакам относят не низкий уровень инсулина в крови, а сниженную экспрессию рецепторов инсулина в тканях-мишенях или же нарушение в проведении ре-гуляторного сигнала от рецептора инсулина к переносчику глюкозы в плазматической мембране клеток. Больные СД-2 составляют 80 — 90% всех больных СД.
В данной работе впервые проведен анализ ДНКазной активности АТ в крови пациентов с СД-1 и СД-2. Показано, что сразу после получения гомогенных препаратов АТ с помощью хроматографии в жестких условиях они не активны или их активность очень низкая. Она медленно увеличивается после диализа и хранения в нейтральном буфере в течение 1 — 10 месяцев, в условиях предотвращающих бактериальную контаминацию. При этом происходит заметная деградация олигомерных форм АТ с образованием фрагментов с различной молекулярной массой, включая свободные легкие цепи АТ, которые более активны в гидролизе ДНК, чем исходные молекулы АТ.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использованы следующие реагенты: трис, 2-дитиотреитол, персульфат аммония, ЭДТА, агароза, («Serva», Германия), SDS («Merck», Германия), ^№-метиленбисакри-ламид, акриламид, бромфеноловый синий, Protein А-Sepharose и Protein G-Sepharose («Pharmacia», Швеция), хлорид магния, («Sigma», США). Суперскрученная плазмид-ная ДНК Bluescript получена от Д.В. Бугреева (ИХБФМ СО РАН). Все остальные реагенты отечественного производства были квалификации ос. ч.
Исследуемые группы
Исследуемые группы состояли из 20 больных с СД-1 и 20 пациентов с СД-2, проходящих лечение в Новосибирской городской больнице, а также 10 здоровых доноров. Диагнозы СД-1 и СД-2 были поставлены согласно стандартным критериям и классификации, предложенным комитетом экспертов ВОЗ по СД в 1980 г. [43 — 44]. Для проведения различного рода анализов нами использовалась плазма крови, приготовленная по стандартной методике [45]. Плазма крови была использована в экспериментах по ИФА.
Иммуноферментный анализ анти-ДНК антител
В работе использовали тест-системы для ИФА-анализа АТ к нативной и денатурированной ДНК производства ООО «Специализированные научные лаборатории» (г. Москва). Все операции проводили согласно стандартной методике производителя. Относительное содержание анти-ДНК АТ в исследуемых образцах выражали в единицах оптического поглощения (ОП) растворов в лунках при 450 нм (ед. А450; среднее из 3 измерений). Измерения ОП проводили с помощью многоканального спектрофотометра (Пущино-на-Оке). Полученные значения ОП нормировали на ОП положительной контрольной сыворотки.
Выделение IgG антител
Белки плазмы крови осаждали сульфатом аммония (50% от насыщения). Раствор центрифугировали, осадок растворяли в TBS буфере (25 мМ трис-HCl, pH 7,5, 150 мМ NaCl) до объема исходной сыворотки и диализова-ли против 20 мМ Трис-HCl при 4°С. Далее для выделения IgG антител использовали два подхода. В первом случае иммунокомплексы осаждали 6%-ым ПЭГ-6000 согласно [33]. Осадок отделяли центрифугированием, а полученный раствор наносили на колонку с Protein A-Sepharose (1 мл), уравновешенную TBS буфером. В случае второго подхода для получения IgG антител осадок иммунокомплексов растворяли в TBS буфере и наносили на колонку с Protein A-Sepharose (1 мл). Обе колонки промывали TBS до исчезновения поглощения элюата. Неспецифически адсорбированные белки элюировали с сорбентов 50 мМ трис-HCl, рН 7,5 (пять объемов колонки), содержащим 0,3 М NaCl и 1%-ный Тритон X-100, а затем промывали 50 мМ Трис-HCl, содержащим 0,3 М NaCl до полного исчезновения поглощения элюата. АТ элюировали с сорбентов 0,1 М глицин-HCl, pH 2,6. Сразу после выхода с колонки фракции, содержащие АТ нейтрализовали 1 М трис-НС буфером, рН 8,5, и концентрировали и при необходимости диа-лизовали (см. ниже).
Дополнительную очистку IgG, полученных с помощью первого и второго методов, описанных выше, проводили с помощью высокоэффективной гель-фильтрации в жестких условиях на колонке Superdex 200 HR 10/30 (100 х 300 мм; хроматограф Sprint Biocad, «Pharmacia»), уравновешенной 0,1 М глицин-
HCl, рН 2,6 [29]. Перед нанесением образца на колонку 0,25 мл раствора АТ (~ 1-3 мг/мл) выдерживали 30 мин в 0,1 М глицин-НС1 буфере, рН
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.