РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2009, ТОМ 3(12), № 2
ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ
ОСОБЕННОСТИ ИНДУКЦИИ МЕСТНОГО ИММУННОГО ОТВЕТА У БОЛЬНЫХ УРОГЕНИТАЛЬНЫМ ХЛАМИДИОЗОМ
© 2009 г. А.П. Топтыгина, С.С. Афанасьев, А.Л. Байракова, Е.А. Воропаева, В.А. Алёшкин, Л.И. Кафарская*, М.С. Афанасьев, Е.В. Фандеева
ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора, Москва, Россия;
*
Российский государственный медицинский университет Росздрава, Москва, Россия;
Поступила: 23.01.2009. Принята: 12.05.2009
Работа посвящена изучению влияния экспрессии То11-подобных рецепторов эпителием цервикального канала на местную секрецию цитокинов в зависимости от остроты и давности заболевания урогенитальным хламидиозом. В зависимости от клинико-лабораторных показателей когорту обследованных женщин в возрасте 20 — 38 лет разделили на 4 группы. В первую группу вошли 34 женщины с острым хламидиозом, вторую группу составили 24 пациентки с хронически рецидивирующим хламидиозом, третья группа состояла из 23 клинически и лабораторно здоровых женщин, перенесших в анамнезе урогенитальный хламидиоз, в четвертую группу вошли 15 здоровых женщин не болевших урогенитальным хламидиозом. Показано, что экспрессия мРНК для То11-подобных рецепторов 2 и 4 в клетках цервикального эпителия была значимо выше в первой группе и значимо ниже во второй группе, по сравнению с третьей и четвертой. Также показан высокий уровень продукции ин-терлекина-8, интерлекина-1, интерлекина-6, интерлекина-4, фактора некроза опухолей-а и интерферона-у у женщин с острым хламидиозом и относительно невысокий уровень этих цитокинов при обострении хронического хла-мидиоза. В первой группе выделена подгруппа женщин, отвечавшая на хла-мидийную инфекцию по типу ТЫ. Именно у этих женщин была достигнута клинико-лабораторная ремиссия в результате лечения, тогда как у женщин, ответивших на инфекцию по типу ТЬ2 отмечалась хронизация инфекции. Обсуждается возможность использования уровня экспрессии То11-подобных рецепторов 2 и 4 и местной продукции цитокинов в качестве прогностического критерия излечивания или хронизации урогенитального хламидиоза.
Ключевые слова: То11-подобные рецепторы, цитокины, хламидиоз
ВВЕДЕНИЕ
Открытие Toll-подобных рецепторов (TLR) и их роли в индукции иммунного ответа позволило по-новому взглянуть на соотношение и взаимодействие врожденного и адоптивного иммунитета [1, 2]. Это особенно важно при изучении иммунитета слизистых. Именно через слизистые в организм попадает большая часть патогенов, например Chlamydia trachomatis. Учитывая тропизм этих микроорганизмов к цилиндрическому и, возможно, к переходному эпителию, первичным очагом их локализации при урогенитальном хлами-
Адрес: 125212, Москва,ул. Адм. Макарова10, ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского. E-mail:toptyginaanna@ rambler.ru
диозе (УГХ) является слизистая шейки матки. Эпителиальные клетки активно участвуют в индукции иммунного ответа. Они способны экспрессировать ТЬИ, синтезировать некоторые провоспалительные цитокины, например интерлейкин-1 (ИЛ-1), фактор некроза опухолей-альфа (ФНОа), выступать в качестве антигенпрезентирующих клеток [3]. Все члены семейства ТЬИ распознают связанные с патогенами образцы молекул (паттерны), присутствующие преимущественно на инфекционных агентах, но отсутствующие у хозяина [4]. Эпителиальные клетки урогени-тального тракта способны экспрессировать ТЬИ 1 — 6 на уровне мРНК и только ТЬИ-2 и ТЬИ-4 на уровне белкового продукта [5]. Известно, что ТЬИ-4 специфически реагирует на
бактериальные патогены, имеющие в своей структуре липополисахарид (ЛПС), в частности, C. Trachomatis и другие грамотрица-тельные микроорганизмы, тогда как TLR-2 связывает поверхностные структуры грам-положительных бактерий, такие как гликоли-пиды, липопротеины или пептидогликаны. В большинстве случаев активация TLR-4 вызывает дифференцировку хелперов в сторону Th1, тогда как активация TLR-2 — в сторону Th2 [6].
Целью настоящей работы явилось изучение влияния экспрессии TLR-2 и TLR-4 эпителием цервикального канала (Цк), на цитокиновый профиль слизи Цк в зависимости от остроты и давности заболевания УГХ.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Обследованные пациенты
В исследовании приняло участие 96 женщин в возрасте 20 — 38 лет. На основании анамнеза, клиники и результатов лабораторной диагностики они были разделены на четыре группы. Первая группа состояла из 34 женщин имевших выраженную клинику острого УГХ, что подтверждалось присутствием в крови специфических антител в значимых титрах, положительными результатами реакции прямой иммунофлуоресценции (РИФ), полимеразной цепной реакции (ПЦР) и куль-турального посева на хламидии. Во вторую группу вошли 24 пациентки с диагнозом хронического рецидивирующего УГХ, длительность заболевания составляла 3 — 5 лет. У всех женщин этой группы отмечалось по крайней мере два рецидива за последний год. На момент обследования у всех пациенток второй группы отмечался клинически и лабораторно подтверждённый рецидив заболевания. Все пациентки неоднократно получали антибактериальную терапию, однако не наблюдалось стойкого клинического и бактериологического положительного эффекта. Третью группу составили 23 клинически здоровые женщины, в анамнезе которых ранее диагностировался УГХ, в крови определялись специфические IgG-антитела, соответствующие давно перенесенной инфекции. В то же время РИФ, ПЦР и культуральный посев были отрицательными в течение 1 года. Четвертая группа состояла из 15 клинически здоровых женщин. Клинико-лабораторное обследование не подтверждало наличие у них каких-либо
признаков инфекций и гинекологической патологии. У всех обследованных женщин было получено информированное согласие на процедуру забора биологического материала и разъяснены цели исследования.
Определение экспрессии генов TLR-2 и TLR-4
Мазки-соскобы со слизистой Цк брали с помощью стерильных урогенитальных зондов, позволяющих получить слой поверхностных эпителиальных клеток. Содержимое зондов суспендировали в забуференном фосфатами физиологическом растворе в пробирках типа «Эппендорф» с последующим определением количества эпителиальных клеток с помощью слайд-планшета (Плива-Лахема, Чехия). Конечная концентрация клеток в образце составляла не более 1 х 105 клеток в мл. Полученный материал суспендировали в растворе EverFresh RNA (ЗАО «Силекс» г. Санкт-Петербург) в соотношении 1 : 5 относительно объема клеточной суспензии. Уровень экспрессии генов TLR определялись ПЦР в режиме реального времени, совмещенной с обратной транскрипцией (RealTime PCR, USA) с помощью детектирующего амплификатора АМК-32 («Синтол», Россия) и специфических праймеров к TLR-2 (TLR2-F1-CCTTCACTCAGGAGCAGCAAGC; TLR2 — R1 - TGGAAACGGTGGCACAGGAC) и TLR-4 (TLR4-F6 -
GAAGGGGTGCCTCCATTTCAGC; TLR4-R6 - GCCTGAGCAGGGTCTTCTCCA). Количество исследуемых кДНК в образцах рассчитывали путем определения пороговых циклов ПЦР в РВ на образцах серийных разведений очищенного ПЦР-продукта в качестве матрицы. Нормализация количества изучаемых транскриптов к общему количеству кДНК в пробе определялась через отношения TLR2/GAPDH и TLR4/GAPDH. Экспрессию генов TLR оценивали в относительных единицах (ОЕ).
Определение цитокинов в цервикальном секрете женщин
Слизь Цк с помощью стерильных уроге-нитальных зондов забиралась у обследуемых женщин, разводилась в 500 мкл забуферен-ного фосфатами физиологического раствора и хранилась при -40 °С не более 3 месяцев. Содержание в слизи Цк ИЛ-Щ ИЛ-4, ИЛ-
6, ИЛ-8, ИЛ-9, ИЛ-10, ИЛ-12, интерферон-гамма (ИФНу), ФНОа, гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) оценивали методом проточной флуориметрии на двулучевом лазерном автоматизированном анализаторе (Bio-plex Protein Assay System, Bio-Rad, USA) с использованием коммерческих тест-систем 10-Plex (определяемый динамический диапазон 0,2 — 3200 пг/мл) в соответствии с инструкцией фирмы-производителя. Постановку всех реакций проводили в 96 —луночном планшентном формате. Количество цитоки-нов в исследуемых образцах определяли с использованием стандартных калибровачных разведений, концентрации цитокинов высчитывали автоматически с использованием программы «Bio-Plex Manager». Количество цитокинов было пересчитано на миллиграмм белка в исследуемой пробе слизи Цк.
Статистическая обработка материала
Полученные результаты исследований были подвергнуты обработке методами вариационной статистики с вычислением средней арифметической и ее стандартной ошибки (М ± m). Для каждого показателя проверялась статистическая гипотеза о нормальности распределения данных по критерию о равенстве дисперсий. В случае нормального распределения о достоверности различий средних величин судили по критерию Стьюдента (t). Различия считались достоверными при р < 0,05. Вычислялся коэффициент ранговой корреляции по Спирмену. Статистическую обработку полученных данных проводили с применением программы Microsoft Exell.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Экспрессия мРНК для TLR-2 и TLR-4 в клетках эпителия пациенток первой группы составила 57,0 и 34,8 ОЕ и оказалась значимо выше не только по сравнению с контрольной четвертой группой — 17,02 и 13,8 ОЕ, соответственно (см. рис.), но и достоверно выше соответствующих значений для второй и третьей группы (p < 0,05). В то же время, у женщин с хронически рецидивирующим УГХ в стадии обострения (группа 2), эти значения оказались значимо ниже, чем у контрольной группы и составили 5,71 и 8,01 ОЕ, соответственно. Экспрессия TLR-2 и TLR-4 в третьей
70 п
60-
50-
40-
30-
20-
10-
Рис. Экспрессия мРНК для ТоП-подобных рецепторов эпителиальными клетками слизистой цервикального канала у женщин с урогенитальным хламидиозом. По оси абсцисс 1 — группа 1, 2 — группа 2, 3 — группа 3, 4 — группа 4.
По оси ординат — Экспрессия мРНК для ТЬЯ в относительных единицах (ОЕ).
Светлые столбики — ТЬЯ2, темные столбики — ТЬЯ4.
группе не отличалась от таковой в контрольной группе.
Для удобства анализа десять исследованных цитокинов были разделены на подгруппы по преимущественному типу действия. В первую подгруппу вошли ИЛ-8 и ГМ-КСФ, поскольку предполагается их воздействие в первую
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.