УДК 577.23
ОСОБЕННОСТИ ИНГИБИРОВАНИЯ ПАЛЬМИТИНОВОЙ КИСЛОТОЙ ГЛИЦЕРОЛ-3-ФОСФАТ-ОКСИДАЗНОЙ АКТИВНОСТИ МИТОХОНДРИЙ ПЕЧЕНИ В ПРИСУТСТВИИ АТР И трет-БУТИЛГИДРОПЕРОКСИДА
© 2015 г. В. Н. Самарцев*, М. В. Дубинин, О. Э. Краснощекова
Марийский государственный университет, 424001, Йошкар-Ола, пл. Ленина, 1; *электронная почта: samvic56@mail.ru Поступила в редакцию 14.01.2015 г.
Исследовано влияние пальмитиновой кислоты на окисление глицерол-3-фосфата, т.е. на глицерол-3-фосфат-оксидазную (ГФ-оксидазную) активность, в митохондриях печени в отсутствие и в присутствии АТР, а также при индуцированном трет-бутилгидропероксидом (ТБГ) окислительном стрессе. Установлено, что пальмитиновая и лауриновая кислоты ингибируют ГФ-оксидазную активность деэнергизованных митохондрий печени формально по конкурентному типу. При этом лауриновая кислота, будучи менее гидрофобной, чем пальмитиновая, ингибирует ГФ-оксидазную активность митохондрий существенно слабее. Отмечается, что конкурентное ингибирование этими насыщенными жирными кислотами ГФ-оксидазной активности митохондрий может быть связано с их способностью как амфифильных соединений, увеличивать плотность отрицательных зарядов на наружной поверхности внутренней мембраны митохондрий. Показано, что ATP в концентрации 2 мМ устраняет способность пальмитиновой кислоты ингибировать ГФ-оксидазную активность митохондрий. Такое действие АТР не наблюдается в присутствии ингибитора ^О^-АТР-синтазы олигомицина. По-видимому, при вызванном гидролизом АТР векторном переносе Н+ из матрикса в межмембранное пространство митохондрий на наружной поверхности внутренней мембраны происходит протонирование анионов пальмитиновой кислоты и последующее перемещение ее нейтральных молекул на внутренний монослой внутренней мембраны. Выяснено, что ТБГ в концентрации 300 мкМ, не оказывая существенного влияния на АТР-азную активность митохондрий печени, в присутствии АТР и пальмитиновой кислоты ингибирует их ГФ-оксидазную активность формально по конкурентному типу. Антиоксидант тиомочевина устраняет такое действие ТБГ. Предполагается, что индуцированный ТБГ окислительный стресс в условиях энергизации митохондрий АТР приводит к увеличению скорости переноса анионов пальмитиновой кислоты с внутреннего монослоя внутренней мембраны на наружный ее монослой. Это, в свою очередь, сопровождается увеличением плотности отрицательных зарядов на наружной поверхности внутренней мембраны митохондрий и ингибированием ГФ-оксидазной активности митохондрий печени формально по конкурентному типу.
Ключевые слова: митохондрии, глицерол-3-фосфат, пальмитиновая кислота, окислительный стресс.
Б01: 10.7868/8023347551503007Х
ВВЕДЕНИЕ
Глицерол- 3 -фосфат-дегидрогеназа митохондрий (мГФДГ, [КФ 1.1.5.3]) — флавин-зависимый фермент, расположенный на наружной поверхности внутренней мембраны, окисляет глицерол-3-фосфат (ГФ) до дигидрооксиацетонфосфата с передачей электронов и ионов водорода непосредственно на кофермент р, минуя комплекс I дыхательной цепи [1—4]. В настоящее время этот фермент идентифицирован и выделен из митохондрий самых различных органов и тканей млекопитающих: печени, скелетных мышц, головного мозга, бурой жировой ткани и т.д. [1—3]. мГФДГ совместно с МЛЭ-зависимой цитоплазматической
глицерол-3-фосфат-дегидрогеназой [КФ 1.1.1.8] является составной частью специального челночного механизма, который обеспечивает аэробное окисление образованного в процессе гликолиза цитозольного МЛЭН, а также принимает участие в метаболизме липидов [1]. Установлено, что мГФДГ ассоциируется с внутренней мембраной митохондрий путем гидрофобных взаимодействий в пределах наружного монослоя [1]. Показано, что олеиновая кислота в митохондриях печени способна ингибировать окисление ГФ при участии этого фермента конкурентно [4] или, согласно другим данным, неконкурентно [1]. Ионы магния, кальция и некоторых других двухвалент-
ных катионов повышают активность этого фермента и ослабляют ингибирующий эффект жирных кислот [1, 4, 5]. Предполагается, что ингибирующее действие олеиновой кислоты обусловлено ее способностью как амфифильного соединения увеличивать плотность отрицательных зарядов на наружной поверхности внутренней мембраны митохондрий [4], снижая локальную концентрацию отрицательно заряженных ионов ГФ в прилегающем к мембране слое по сравнению со средней объемной концентрацией. Это при окислении ГФ митохондриями проявляется как увеличение кажущейся Km без изменения кажущейся Vmax [4]. Согласно альтернативной точке зрения, ингиби-рование олеиновой кислотой активности мГФДГ может быть связано с модификацией состояния липидного бислоя внутренней мембраны митохондрий [1, 6]. Следует отметить, что олеиновая кислота, будучи ненасыщенной, в отличие от насыщенных жирных кислот может подвергаться перекисному окислению по двойной связи, что, в свою очередь, может влиять на состояние липидного бислоя мембран [7]. Представляет интерес изучение действия насыщенных жирных кислот на окисление ГФ при участии мГФДГ в митохондриях печени, т.е. на глицерол-3-фосфат-оксидазную (ГФ-оксидазную) активность этих органелл.
Митохондрии высших животных являются не только высокоэффективными энергетическими станциями, вырабатывающими АТР и тепло, но и основным источником активных форм кислорода (АФК), образующихся в клетке [8, 9]. Известны различные пути формирования АФК в митохондриях [9], один из которых — окисление ГФ мГФДГ [3]. Гиперпродукция АФК приводит к окислительному повреждению митохондрий, которое рассматривается как один из основных факторов гибели клеток [8, 9]. В настоящее время большой интерес вызывает изучение механизма действия адресованных в митохондрии антиокси-дантов в связи с их возможным использованием как защитных средств при патологиях, вызванных окислительным стрессом [10—12].
Насыщенные жирные кислоты известны как эффективные природные разобщители окислительного фосфорилирования [13—15]. В митохондриях печени протонофорное разобщающее действие жирных кислот осуществляется главным образом при участии белков-переносчиков метаболитов внутренней мембраны митохондрий: ADP/ATP- и аспартат/глутаматного антипорте-ров [13—15]. Ранее нами было установлено [14, 15], что в митохондриях печени разобщающая активность одной из насыщенных жирных кислот, пальмитиновой, в присутствии физиологических субстратов ADP/АТР- и аспартат/глутаматного антипортеров ADP и аспартата повышается при окислительном стрессе, вызванном эндогенными процессами при старении животных или индуцированном трет-бутилгидропероксидом (ТБГ).
Предполагается, что в этих условиях усиление свободно-радикальных и перекисных реакций приводит к повышению скорости переноса анионов пальмитиновой кислоты с внутреннего монослоя мембраны на наружный при участии ADP/АТР- и аспартат/глутаматного антипортеров [14, 15]. Очевидно, что усиленный выброс анионов пальмитиновой кислоты из матрикса митохондрий должен привести к увеличению их содержания на наружном монослое внутренней мембраны. Это, в свою очередь, может вызывать увеличение количества отрицательных зарядов на наружном монослое, уменьшение локальной концентрации отрицательно заряженных ионов в прилегающем к мембране слое и, следовательно, изменение каталитических свойств ферментов, расположенных на наружной поверхности внутренней мембраны, в том числе и мГФДГ. Необходимо отметить, что данные о действии жирных кислот на энергетические функции митохондрий получены в условиях энергизации органелл при окислении сукцината в большой концентрации. Вместе с тем известны патологические состояния, при которых наблюдается ингибирование транспорта электронов по дыхательной цепи митохондрий и энергизация этих органелл, главным образом, за счет гидролиза АТР [16]. В этом случае в запасании энергии в форме разности электрохимических потенциалов ионов водорода (ДЦН+) принимает участие /Ofx-ATP-синтаза, осуществляющая векторный перенос Н+ из матрикса в межмембранное пространство в процессе гидролиза АТР. Специфическим ингибитором этого процесса является олигомицин [8, 16].
В настоящей работе предпринята попытка исследовать действие насыщенных жирных кислот: пальмитиновой и лауриновой как ингибиторов ГФ-оксидазной активности митохондрий печени, а также выяснить как изменится ингибирую-щее действие наиболее эффективной из этих жирных кислот при условии энергизации митохондрий путем чувствительного к олигомицину гидролиза АТР и при действии одного из окисляющих агентов ТБГ.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Митохондрии из печени белых половозрелых крыс-самцов массой 210—250 г выделяли общепринятым методом дифференциального центрифугирования с последующим освобождением от эндогенных жирных кислот с помощью свободного от жирных кислот бычьего сывороточного альбумина как подробно описано ранее [13]. Среда выделения содержала 250 мМ сахарозу, 1 мМ EGTA, 5 мМ HEPES (рН до 7.4 доводили трис). Концентрацию белка митохондрий определяли биуретовым методом, в качестве стандарта использовали бычий сывороточный альбумин. Во
время проведения эксперимента суспензию митохондрий (70—80 мг митохондриального белка в 1 мл) хранили на льду.
ГФ-оксидазную активность митохондрий печени определяли путем регистрации потребления кислорода при окислении ГФ полярографическим методом [4] с помощью кислородного электрода типа Кларка в термостатируемой ячейке объемом 1 мл при температуре 37°С. Среда инкубации содержала 250 мМ сахарозу, 0.5 мМ EGTA, 10 мМ HEPES (рН до 7.4 доводили трис). При определении активности в полярографическую ячейку сразу после митохондрий (~1.5 мг/мл) добавляли ротенон (3 мкМ), через 2 мин после этого ГФ в концентрации 2—16 мМ. Значения кажущихся Кт и Ктах, характеризующих зависимость скорости ГФ-оксидазной активности (V) от концентрации ГФ ([«]) определяли как параметры линейного регрессионного уравнения:
^ Кт г п + ^шах,
И
методом наименьших квадратов на персональном компьютере с помощью пакетов прикладных программ $1аИ8Иеа-6.0.
Изменение Ау на внутренней мембране митохондрий оценивали по перераспределению катионов тетрафенилфосфония (ТФФ+), концентрацию которых регистрир
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.