ОНТОГЕНЕЗ, 2014, том 45, № 2, с. 112-120
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЭМБРИОЛОГИЯ
УДК 581.3:576.5:582.475.4
ОСОБЕННОСТИ ИНИЦИАЦИИ ЭМБРИОИДОВ ИЗ МЕГАГАМЕТОФИТОВ PINUS SIBIRICA В КУЛЬТУРЕ IN VITRO
© 2014 г. И. Н. Третьякова, Е. В. Ворошилова*
Институт леса им. В.Н. Сукачева СО РАН 660036 Красноярск, Академгородок 50, стр. 28 *Сибирский федеральный университет 660041, Красноярск, пр. Свободный 79 E-mail: culture@ksc.krasn.ru Поступила в редакцию 03.06.13 г. Окончательный вариант получен 11.09.13 г.
Мегагаметофиты кедра сибирского вводили в культуру in vitro на среду 1/2 LV, дополненную регуляторами роста 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислотой (2,4-Д) бензиламинопурином (6-БАП) с целью образования эмбриоидов. Компетентность соматических клеток эксплантов к эмбриогенезу проявлялась в организованном росте и полярности. В культуре мегагаметофитов происходило образование длинных вакуолизированных клеток — формировался ценоцит. Далее наблюдалась миграция ядер к одному из полюсов клетки, их деление и формирование эмбриоидов. Культура мегагаметофитов кедра сибирского отличалась от культуры зиготических зародышей отсутствием асимметричного деления в вакуолизированной клетке.
Ключевые слова: Pinus sibirica, мегагаметофиты, соматический эмбриогенез, эмбриоиды.
DOI: 10.7868/S0475145014020074
ВВЕДЕНИЕ
Соматический эмбриогенез является наиболее перспективным направлением в лесной биотехнологии и широко применяется за рубежом при реализации программы MVF (Park, 2002, 2010). В качестве эксплантов, как правило, используют зрелые и незрелые зиготические зародыши (Nag-mani, Bonga, 1985), реже мегагаметофиты (Kli-maszewska, Cyr, 2002) и сегменты вегетативных побегов (Malabadi, Van Staden, 2005).
Гаплоидный каллус из мегагаметофитов хвойных впервые был получен в 1985 г. у Larix decidua (Nagmani, Bonga, 1985; von Aderkas, Bonga, 1988), а затем у Picea abies (Simola, Santanen, 1990). В дальнейшем эксперименты по исследованию гаплоидных культур и эмбриоидов не проводились, т.к. внимание ученых было сосредоточено на изучении соматического эмбриогенеза, полученного из диплоидных тканей и получении сеянцев для плантационного лесовыращивания. В 2009 г. нами впервые были опубликованы результаты биотехнологической работы по индукции соматического эмбриогенеза из незрелых зародышей вместе с мегагаметофитами у Pinus sibirica. При этом эмбриогенный каллус развивался в единичных случаях (Третьякова, Ижболдина, 2009).
Сосна сибирская, кедр сибирский (Pinus sibirica Du Tour) — один из основных лесообразователей гор Южной Сибири, подвергается хищническому истреблению из-за антропогенной нагрузки. Между тем, репродуктивные процессы данного вида имеют ряд особенностей, отличающих его от других представителей хвойных, произрастающих на территории Сибири. Это высокая полиэм-бриональность (до 16 зародышей в одном мегага-метофите) и необходимость длительной стратификации семян (4—7 мес.) (Третьякова, 1990), а также встречаемость в природных популяциях уникальных гетерозисных генотипов деревьев с однолетним циклом развития женской шишки, у которых наблюдается акселерация генеративного цикла (Ирошников, 1974; Минина, Ларионова, 1979). Акселерация генеративного развития у рассматриваемых форм кедра сибирского проявлялась в сверхраннем развитии гаметофитов. Стадия гаме-тогенеза, происходила за 1.5—2 мес. (вместо 1 года) и завершалась развитием архегониев. Однако оплодотворения яйцеклеток не происходило из-за медленного роста пыльцевых трубок и зародыши не образовывались (Третьякова, 1990). Таким образом, размножение уникальных гетерозисных форм Pinus sibirica естественным половым путем невозможно, что обусловило необходимость раз-
работки биотехнологий воспроизведения данных генотипов.
Целью настоящей работы явилось разработка биотехнологии получения гаплоидного эмбрио-генного каллуса в культуре мегагаметофитов и изучение особенностей эмбриоидогенеза у Pinus sibirica.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследования проводили на прививочной клоновой плантации сосны сибирской, кедра сибирского (Pinus sibirica Du Tour), созданной Ю.А. Череповским с сотрудниками в начале 1990-х г., расположенной на территории Даурского лесничества вблизи поселка Ермаковское (53°16' с.ш. и 92°23' в.д., высота над уровнем моря 300—320 м). Плантация занимает площадь 10 га. Каждый клон представлен прививками плюсовых деревьев кедра сибирского из естественного древостоя Западного Саяна, и состоит из 12—15 деревьев (рамет), возраст которых составил 18—20 лет.
Клоны кедра сибирского отличаются неравномерным урожаем женских шишек в погодичном цикле. Обильные урожаи (2009, 2011) сменяются неурожайными годами (2010, 2012) (Третьякова и др., 2012, в печати). В 2012 г. на клоновой плантации урожай женских шишек практически отсутствовал. Только у пяти клонов (№№ 277/22, 281/26, 283/26, 145/4 и 153/13) были обнаружены немногочисленные женские шишки (от 1 (клон № 277/22) до 7 шт. (клон № 145/4)).
Для исследований по культуре ткани в первой декаде июля с каждого клона кедра сибирского проводили сбор женских шишек, полученных в результате свободного опыления и самоопыления клонов. В период взятия образцов зародыши находились на кливажной и глобулярной стадиях развития.
Для введения в культуру in vitro мегагаметофи-тов кедра сибирского, семена предварительно обрабатывали водным раствором перманганата калия, затем отмывали в проточной воде и очищали от покровов. Извлеченные мегагаметофиты стерилизовали гипохлоритом натрия в течение 10 мин, трижды промывали в стерильной дистиллированной воде и помещали на 5 мин в 10% раствор перекиси водорода. Затем в стерильных условиях мегагаметофиты рассекали на две части или отделяли сегменты, удаляли зародыш и помещали на питательную среду срезом вверх или вниз, по 6— 7 эксплантов на колбу.
Для индукции соматического эмбриогенеза использовали базовую питательную среду 1/2LV (Litvae et al., 1985), с добавлением сахарозы (30 г/л), глютамина (1 г/л), гидролизата казеина (0.5 г/л), мезоинозита (1 г/л) и аскорбиновой кис-
лоты (0.3 г/л). В качестве регуляторов роста использовали 2,4-Д и 6-БАП в концентрации 2 и 1 мг/л соответственно. рН среды доводили до 5.8 перед автоклавированием. Помещенные на среду экспланты культивировали в темноте при 25 ± 1°С в течение 60 сут. Далее образовавшийся каллус переносили на среду для пролиферации, с пониженным содержанием сахарозы (20 мг/л) и 6-БАП (0.5 мг/л). Пересадку на свежую питательную среду проводили каждые 14 сут. Для сравнения интенсивности роста культур, образующийся каллус взвешивали при каждой пересадке и брали образцы для цитологического анализа.
Для проведения цитологического анализа готовили давленые препараты по стандартной методике (Паушева, 1990). Каллус помещали на предметное стекло, взвешивали, окрашивали гематоксилином с добавлением капли железных квасцов в течение 5—10 мин, добавляли каплю глицерина, накрывали предметным стеклом, после чего слегка придавливали.
Препараты просматривали на микроскопе "МИКРОМЕД-6" ЛОМО, при увеличении 10 х 4, 10 х 10 и 10 х 40. Замеры клеток и эмбриональных структур проводили при помощи системы Scope Photo, с последующим переводом полученных единиц в микрометры. Статистическую обработку данных проводили по стандартным методикам (Рокиц-кий, 1973) при помощи программы Microsoft Excel 2003.
РЕЗУЛЬТАТЫ
При введении эксплантов кедра сибирского в культуру in vitro, на 7—10 сут культивирования происходило формирование каллуса в коррозийной полости вдоль продольной оси мегагамето-фита, расположенного срезом вверх. Каллусная масса имела белый цвет, плотную или рыхлую структуру. У мегагаметофитов, расположенных срезом вниз, образования каллуса не происходило.
Через 1 мес. культивирования у значительного большинства эксплантов каллус покрывал всю поверхность среза (рис. 1). К концу стадии инициации (60 сут) вес каллуса составлял от 0.052 ± ± 0.001 г (клон № 283/26) до 0.088 ± 0.001 г (клон № 281/26) (рис. 2). Первичный отклик эксплантов составил от 20 (клон № 281/26) до 85.7% (клон № 145/4) (рис. 3).
При перенесении каллусов на среду для пролиферации с пониженным содержанием сахарозы и 6-БАП, эмбриогенный каллус образовывался только у двух клонов — № 283/26 и № 153/13. Число эксплантов, вышедших на стадию пролиферации, у данных клонов составило 68.7 и 66.7% соответственно. На 120 сут культивирования вес пролиферирующих каллусов составил 0.077 ±
и
F
(в)
(г)
Рис. 1. Культуры мегагаметофитов клонов 277/22 (а) и 281/26 (б), 283/26 (в), 153/13 (г) (бар 1 см).
± 0.001 г (клон № 283/26) и 0.098 ± 0.001 г (клон № 153/13) (рис. 2).
Каллусы, полученные от свободноопыленных и самоопыленных клонов №№ 277/22, 281/26 и 145/4 характеризовались плотной структурой и оказались неэмбриогенными. Через 4 мес. культивирования каллусы клона № 281/26 полностью некротизировали. Рост остальных каллусов продолжался.
Цитологический анализ
На 7—10 сут культивирования мегагаметофитов вдоль продольной оси среза наблюдалось растяжение клеток у четырех клонов, за исключением клона № 277/22, у которого клетки сохраняли изодиаметрическую форму, характерную для клеток мегагаметофита. К концу первого месяца культивирования на среде для инициации образовавшийся каллус состоял из вытянутых вакуо-лизированных клеток, длина которых в среднем составляла 495 ± 24.2 мкм. Большинство данных клеток не завершали цитокинез, в результате чего в клетке образовывались два ядра (рис. 4а), которые делились, и формировался четырехядерный ценоцит. Эти четыре ядра мигрировали к одному из полюсов длинной клетки (рис. 4б), где проис-
ходило формирование клеточных стенок, и образовывались четыре маленькие клетки с темно -окрашенной цитоплазмой (инициалей эмбриоида). К базальному концу этих клеток примыкали безъядерная длинная клетка, которая затем, вероятно, отмирала (рис. 4в). Инициальные клетки эмбриои-дов продолжали делиться, образовывая агрегаты, а затем глобулы соматических эмбриоидов.
Через 2 мес. культивирования, при перенесении каллусов клонов № 283/26 и № 153/13 на пролиферационную среду клетки нижней части глобулы (к которой
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.