ЖУРНАЛ ФИЗИЧЕСКОЙ ХИМИИ, 2011, том 85, № 5, с. 979-986
БИОФИЗИЧЕСКАЯ ХИМИЯ =
УДК 577.150.3
ОСОБЕННОСТИ ИЗОТЕРМ АДСОРБЦИИ БЕЛКОВ НА КРЕМНЕЗЕМНЫХ АДСОРБЕНТАХ © 2011 г. Е. С. Чухрай, Л. Ф. Атякшева, О. С. Пилипенко
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Химический факультет
E-mail: Chukhrai@phys.chem.msu.ru Поступила в редакцию 28.04.2010 г.
Проведено сравнительное исследование изотерм адсорбции гемоглобина, пероксидазы и в-галак-тозидазы на силохроме, мезопористом и бипористом кремнеземах. Установлена двухстадийность адсорбции — "быстрая" обратимая адсорбция белка (равновесие достигается при t < 1—2 ч) и "медленная стадия" — необратимое связывание при t > 24 ч (многоточечная адсорбция). Определены соответствующие константы равновесия. Установлен механизм неограниченной линейной ассоциации пероксидазы в адсорбционном слое на поверхности силохрома.
Ключевые слова: изотерма адсорбции, белок, кремнеземные адсорбенты, константы равновесия, си-лохром.
Широкопористые силикагели и силохромы используют для иммобилизации белков со второй половины XX столетия, а в конце 90-х годов появились первые публикации об использовании для этих целей мезопористых молекулярных сит МСМ-41, МСМ-48, 8ВА-15 [1-3]. По своим адсорбционным и другим физико-химическим характеристикам кремнеземные адсорбенты являются хорошими носителями для глобулярных белков. Они устойчивы в водных буферных средах и обладают слабо выраженными кислотными свойствами. Широкое использование адсорбции как метода иммобилизации ферментов обусловлено возможностью получения прочно связанных с поверхностью адсорбционных слоев белка без существенной потери их каталитической активности. Необратимость адсорбции ферментов позволяет успешно использовать эти гетерогенные катализаторы в пищевой, медицинской и химической промышленности, а также в лабораторной практике в качестве устойчивых биокатализаторов многократного использования.
При изучении адсорбции белков чаще всего обнаруживаются изотермы адсорбции Ь-типа (ленгмюровские), реже — изотермы 8-типа. Изотермы Ь-типа получены для адсорбции гемоглобина на различных силикагелях [4, 5] и мезопористых молекулярных ситах [6], лизоцима на кремнеземах [5], 8ВА-15 и МСМ-41 [7, 8], миоглобина на МСМ-41, 8ВА-15, МСБ, €N8, М8Е [7, 9, 10], БСА [7] и цитохрома с [10] на 8ВА-15. Изотермы 8-типа получены при адсорбции гемоглобина на силикагеле, модифицированном монослоем холестерина [4], пероксидазы на МСМ-41 [11], лизоцима на 8ВА-15 и МСМ-41 [8] в сильно щелочных средах.
Адсорбция белков практически необратима, но их можно десорбировать изменив рН или ионную силу контактного раствора [4]. Необратимость адсорбции белка вносит принципиальные трудности в теоретическую трактовку наблюдаемых явлений. Поэтому на первый план выступает кинетическое изучение процессов адсорбции белка [12].
Даже при необратимости связывания белка с адсорбентом экспериментально обнаруживается предшествующая обратимая стадия [11—13]. В этом случае образованию прочных связей (многоточечная адсорбция) предшествует обратимая адсорбция. Простейшая двустадийная кинетическая схема иммобилизации фермента на твердом носителе выглядит так:
E + D.
EQ с
->EQ п
(1)
где Е — фермент в растворе, ^ — контактная площадка носителя, Е^сл и Е^пр — слабо и прочно связанный фермент на носителе соответственно, к_1 и кпр — константы скорости первого порядка, а к1 — второго порядка. Очевидно, что первая стадия объединяет все возможные обратимые взаимодействия белка с носителем и поэтому константа равновесия адсорбции является эффективной (Кэфф = Лимитирующей стадией процесса является необратимое многоточечное связывание, для реализации которого при адсорбции белков из нейтральных растворов на твердых носителях при комнатных температурах требуется не менее 24 ч. Для установления адсорбционного равновесия на первой обратимой стадии необходимо время приблизительно в десять раз меньше.
k
k
Б
C - N -
- C - N -
^ II I
Рис. 1. Схема образования водородных связей (А) между элементами пептидной связи (Б) на поверхности белка и силанольными группами кремнеземов.
Цель данной работы — сравнительное исследование изотерм адсорбции белков различной молекулярной массы и олигомерного состава на кремнеземных адсорбентах и определение типа адсорбционного взаимодействия.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Исследована адсорбция пероксидазы, гемоглобина и ß-галактозидазы на макропористом си-лохроме, мезопористом и бипористом кремнеземах. Мезопористый (Бср = 5 нм) и бипористый (D = 4.5 и ~45 нм) адсорбенты синтезированы методом темплатного синтеза.
Использованы следующие препараты: бычий гемоглобин (Reanal) с содержанием белка 98%, пе-роксидаза хрена (Sigma) с содержанием фермента 42% и ß-галактозидаза (LAC) из грибов Penecillium canescens с содержанием белка 15%. Пероксидаза хрена — мономерный белок (MR = 39000), а гемоглобин и ß-галактозидаза (LAC) — тетрамеры с молекулярными массами 65000 и 480000 соответственно.
Адсорбцию белков проводили при температуре 6°С. Навеска адсорбента составляла 10—100 мг, объем раствора — 5 или 10 мл. Время адсорбции варьировали от двух часов до пятнадцати суток. Использовали нейтральные водные растворы пе-роксидазы и гемоглобина. Их концентрацию определяли спектрофотометрически (X = 400 нм). Адсорбцию LAC проводили в оптимуме рН активности фермента (рН 4.5) из фосфат-цитратно-го буфера. Концентрацию LAC считали пропорциональной ферментативной активности, которую определяли по начальной скорости гидролиза
о-нитрофенил^^-галактопиранозида (Sigma). Анализировали концентрацию продукта гидролиза (о-нитрофенол) фотометрированием при 420 нм в щелочной среде. Величину адсорбции рассчитывали по разнице концентраций белка в растворе после адсорбции и холостой пробе.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Сложность белка как адсорбата связана с неоднородностью его свойств: наличием олигомерных структур, присутствием на поверхности неодинаковых контактных участков, возможностью многоточечного связывания белка с носителем и рядом других факторов. Топография поверхности белковой глобулы формируется выступающей наружу частью полипептидной цепи, которая состоит из пептидных единиц (мономеров) — CaRH—CO—NH—. Радикал R у a-углеродного атома представляет собой полярный, но чаще неполярный или гидрофобный аминокислотный остаток. На различных участках поверхности эти остатки формируют неполярные или полярные скопления, создавая соответствующие контактные участки. Пептидные связи — CO—NH— взаимодействуют с поверхностью адсорбента, образуя водородные связи с силанольными группами поверхности. Схематически это изображено на рис. 1. Энергия водородной связи (4—20 кДж/моль) значительно меньше энергии ковалентной связи и соизмерима с энергией теплового движения при 25°С. Поэтому при обратимой адсорбции водородные связи могут легко образовываться и легко разрушаться.
Многоточечное связывание белка с поверхностью возникает не сразу: на первом этапе связывание белка с поверхностью обеспечивается минимальным числом водородных связей, которые легко возникают и легко разрушаются (обратимая стадия). Необратимое связывание возникает, когда поверхность белка контактирует с поверхностью носителя той частью поверхности, где возможно образование оптимально возможного числа водородных связей. Молекулярные площадки, рассчитанные из геометрических размеров молекул белков, составляют приблизительно 20, 40 и 140 нм2 соответственно для пероксидазы, гемоглобина и LAC. Поверхностная концентрация гидроксильных групп на предельно гидроксили-рованных кремнеземах составляет около 4.8 ОН-групп на 1 нм2 [14]. При необратимой адсорбции белковой молекулы возникает многоточечная адсорбция за счет оптимально возможного числа водородных связей между белком и носителем. Водородные связи обеспечивают также и стабильность третичной и четвертичной структуры молекул белка. Например, в контактных участках тетрамера ß-галактозидазы из E. coli возникает 14 водородных связей и до 50 гидрофобных контактов [15].
Рис. 2. Схема адсорбции (А) белка из нейтральных водных растворов: области I, II, III — обратимая адсорбция, область IV — необратимое связывание, т — время адсорбции.
Схема адсорбции белка на кремнеземных адсорбентах представлена на рис. 2, где римскими I, II, III на оси времен показан предполагаемый механизм обратимой адсорбции (при t ^ 0); а IV — значительно более медленной необратимой адсорбция (при t ~ 24 ч). Поверхность молекулы белка на рис. 2 условно разделена на четыре части: 1 — равномерное распределение полярных и неполярных групп, 2 — небольшие скопления полярных групп, 3 — распределение полярных и гидрофобных групп в пользу последних и 4 — полярный участок поверхности белковой глобулы, формирующий максимальный контактный участок для взаимодействия с поверхностью адсорбента. На рис. 2 показано возникновение одной водородной связи при обратимой адсорбции между первым участком поверхности белка и ОН-группой носителя (а); двух водородных связей между вторым участком белка и носителем (б) и трех связей между третьим участком глобулы и носителем (в). Необратимая многоточечная адсорбция может осуществляться как при адсорбции белка из раствора (г), так и в результате поверхностной миграции молекул белка (д). Адсорбция белка становится необратимой при образовании достаточного числа водородных связей с поверхностью.
Итак, необратимому многоточечному связыванию белка с поверхностью носителя предшествует значительно более быстрая стадия равновесной адсорбции белковой глобулы, образующей одну—три водородные связи с силанольными
группами поверхности. Пусть скорость обратимой адсорбции V, а скорость необратимой адсорбции Ух, тогда V > Ух, и при t ^ 0 необратимой адсорбцией практически можно пренебречь, что позволяет определить константу равновесия адсорбции.
На рис. 3 представлены три типа изотерм адсорбции белковых молекул, полученных экспериментально. Изотермы адсорбции гемоглобина и LAC на силохроме и мезопористом кремнеземе имеют вид изотерм L-типа (рис. 3а). Эти изотермы спрямляются в двойных обратных коор
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.