ИЗВЕСТИЯ РАН. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2013, № 5, с. 565-573
ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ
УДК 581.143.6:576.31
ОСОБЕННОСТИ НАЧАЛЬНЫХ ЭТАПОВ ЭМБРИОИДОГЕНЕЗА in vitro В КАЛЛУСАХ ПШЕНИЦЫ РАЗЛИЧНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ
© 2013 г. О. А. Сельдимирова, Н. Н. Круглова
Институт биологии Уфимского научного центра РАН, 450054 Уфа, просп. Октября, 69
E-mail: kruglova@anrb.ru Поступила в редакцию 14.02.2011 г.
Проведен светооптический и ультраструктурный анализ формирования эмбриоидов в каллусах, полученных в культуре in vitro пыльников и в культуре in vitro зародышей яровой мягкой пшеницы. Выявлены особенности формирования эмбриоидов в каллусах обоих типов.
DOI: 10.7868/S0002332913050159
Один из путей регенерации растений in vitro — эмбриоидогенез, заключающийся в формировании эмбриоида (соматического зародыша) — за-родышеподобной биполярной структуры. Эм-бриоид характеризуется образованием собственной новой (по отношению к материнскому организму) оси и, как правило, не имеет общей сосудистой системы с материнским организмом (закрытый радикулярный полюс) (Батыгина, 1987, 1997, 2000).
Вопрос о клеточных механизмах формирования эмбриоидов в каллусах различного происхождения у пшеницы остается дискуссионным. Имеются сведения как об одноклеточном (Sham-rov et al., 1992; Batygina et al., 1993), многоклеточном (Анапияев, 2001; Konieczny et al., 2003), так и об одновременно одно- и многоклеточном (Schumann et al., 1991; Ilchukov et al., 1992; Fernandez etal., 1999; Бишимбаева, 2007) происхождении эмбриоидов у этого злака.
Информация о происхождении эмбриоидов необходима, поскольку в основе современных инновационных биотехнологий лежит образование полноценных фертильных растений-регене-рантов, в том числе в каллусных культурах in vitro. Эмбриоидогенез рассматривается как биотехно-логически оптимальный путь регенерации растений в каллусной культуре in vitro, так как в этом случае единицей репродукции является зачаток целого организма, а не отдельные органы (Батыгина, 1987, 1997). Кроме того, одноклеточное происхождение эмбриоида предполагает работу с генетически однородным материалом и снижает риск возникновения химерных растений-регене-рантов (Суханов, 1983; Ahloowalia, 1991; Shohet, Calligari, 1991; Горбунова, 1993; Sussex, 2008; Vasil, 2008; Advances..., 2009; Plant cell..., 2009). Это важно при разработке биотехнологий клонирования
хозяйственно-ценных генотипов сельскохозяйственных культур.
Следует отметить, что многие авторы определяют происхождение эмбриоидов, анализируя поздние этапы их развития, опираясь на критерий, приведенный ранее (Williams, Maheswaran, 1986): очевидная связь эмбриоида с каллусной тканью свидетельствует о его многоклеточном происхождении, тогда как отсутствие такой связи — об одноклеточном происхождении эмбриоида. В то же время ясно, что наиболее точная информация о происхождении эмбриоидов может быть получена при анализе самых ранних этапов их формирования.
На примере яровой мягкой пшеницы нами установлено, что начальный этап морфогенеза in vitro в каллусах, полученных в культуре in vitro пыльников и в культуре in vitro зародышей, универсален и состоит в формировании в толще каллуса морфогенетического очага и преобразовании его в поверхностную меристематическую зону. С деятельностью клеток этой зоны связана реализация различных путей морфогенеза in vitro, в том числе и эмбриоидогенеза (Круглова и др., 2005; Батыгина и др., 2010). Статус таких меристе-матических клеток как инициальных подтвержден предварительно полученными нами данными ультраструктурного анализа морфогенных каллусов обоих типов в начале их развития (Сельдимирова и др., 2011). В то же время не полностью изучены начальные этапы такого пути морфогенеза in vitro в каллусах различного происхождения, как эмбриоидогенез.
Цель работы — светооптический и ультраструктурный анализ начальных этапов эмбриоидогенеза в каллусах двух типов: полученных в культуре in vitro пыльников и в культуре in vitro зародышей яровой мягкой пшеницы.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объект исследования — сорт яровой мягкой пшеницы (Triticum aestivum L.) Башкирская 26 (автор сорта — В.И. Никонов, БашкНИИ СХ РАСХН). Согласно предварительным данным пыльники и зародыши этого сорта отзывчивы на условия культуры in vitro (Круглова и др., 2006) и тем самым могут служить удобными моделями для изучения эмбриоидогенеза in vitro.
Морфогенные каллусы в культуре in vitro пыльников получали согласно методическим рекомендациям (Круглова, Батыгина, 2002). Предварительно было выявлено, что такой каллус формировался из одной гаплоидной клетки пыльника — сильновакуолизированной микроспоры (Круглова и др., 2005). Для индукции эм-бриоидогенеза каллусы переносили на среду, составленную по прописи Блейдза (Blaydes, 1966), содержавшую в качестве гормонального компонента только кинетин в концентрации 0.2 мг/л.
Морфогенные каллусы в культуре in vitro зародышей получали методом Суханова и Папазян (1983) в модификации Шаяхметова (1999). В качестве эксплантов использовали незрелые зародыши, находившиеся в третьей подстадии стадии органогенеза (Круглова, 2008). При этом каллус формировался из группы диплоидных клеток щитка (Круглова, Катасонова, 2009). Для индукции эмбриоидогенеза каллусы переносили на среду, составленную по прописи Мурасиге—Скуга (Murashige, Skoog, 1962), содержавшую в качестве гормонального компонента только кинетин в концентрации 0.2 мг/л.
Постоянные микротомные препараты каллусов толщиной 10 мкм для световой микроскопии готовили по общепринятой методике (Барыкина и др., 2004) и окрашивали с помощью реактива Шиффа и йодной кислоты (Дженсен, 1965). Препараты просматривали и фотографировали с применением микровизора проходящего света p.Vizo-103 (ЛОМО ФОТОНИКА, С.-Петербург).
Для просвечивающей электронной микроскопии каллусы готовили согласно методике Гайера (1974). Для ориентации каллусов использовали полутонкие срезы, окрашенные толуидиновым синим (Lynn, 1965). Ультратонкие срезы контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца и анализировали с помощью электронного микроскопа JEM-1200 EX (JEOL, Япония).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В ходе экспериментов установлено, что при индукции эмбриоидогенеза в клетках поверхностной меристематической зоны каллусов обоих типов начинают происходить изменения. В первую очередь это касается клеточных стенок, которые начинают утолщаться, в них исчезают
плазмодесмы. В каллусе, полученном в культуре in vitro зародышей, это связано со значительным возрастанием активности аппарата Гольджи (АГ) — увеличением числа диктиосом, на концах которых имеются многочисленные секреторные везикулы (рис. 1а, б). В каллусе, полученном в культуре in vitro пыльников, в утолщении клеточных стенок, по-видимому, участвует агранулярный эндоплазматический ретикулум (аЭПР), длинные многочисленные каналы которого располагаются параллельно клеточным стенкам (рис. 2а). Как правило, формирование утолщенных клеточных стенок связывают с деятельностью АГ, однако установлено, что в этом процессе может участвовать и аЭПР (Robenek, Peveling, 1977; Наумова, 1997). Плазмодесмы рассматриваются как ключевой регуляторный элемент во взаимодействии клеток, а их отсутствие — как показатель физиологической изоляции (Raghavan, 1997; Plasmodes-mata..., 1999; Namasivayam, 2007). Изоляция — один из признаков достижения клеткой эмбрио-генной компетентности (Merkle et al., 1995; Namasivayam, 2007), поскольку освобождение от позиционных сигналов, по мнению Рагхавана (Raghavan, 1997), позволяет клеткам реализовать присущий им эмбриогенный потенциал.
В обоих случаях начинают формироваться межклетники (рис. 1г, д, 2в), за счет которых расположение клеток в структуре каллусов становится более рыхлым. В двух-трех верхних слоях поверхностной меристематической зоны формируются клетки, окруженные утолщенными клеточными стенками без плазмодесм. Такие клетки отличаются от нижележащих более плотной цитоплазмой. Клетки нижележащих слоев вакуолизируются и становятся паренхиматозными (рис. 1в, г, 2б).
При ультраструктурном анализе клеток поверхностных слоев каллусов обоих типов обнаруживаются хорошо развитые каналы гранулярного эндоплазматического ретикулума (гЭПР) (рис. 1д, 2г), что свидетельствует о синтезе в этих клетках конституционных веществ. У таких клеток в отличие от клеток более ранней стадии развития (Сельдимирова и др., 2011) митохондрии имеют хорошо развитые кристы (рис. 1е, 2д), а пластиды содержат по нескольку крахмальных зерен (рис. 1ж, 2е). В клетках каллусов, полученных в культуре in vitro пыльников, вместе с крахмальными зернами имеется много липидных включений (рис. 2д). Эти данные позволяют сделать вывод об усилении метаболической активности клеток поверхностных слоев каллусов обоих типов, что в свою очередь указывает на готовность этих клеток к процессам, требующим энергетических затрат. Действительно, резервирование метаболитов считается критическим фактором при переходе от одного этапа морфогенеза к другому, когда скорость роста резко возрастает (Батыгин, 1986). Значительное накопление крахмала в каллусных
Рис. 1. Формирование эмбриоидогенных клеток в поверхностной меристематической зоне каллуса, полученного в культуре in vitro зародышей. а, б — ультраструктурные особенности формирования утолщенных клеточных стенок; в — общий вид эмбриогенных клеток; г-ж — ультраструктурные особенности эмбриогенных клеток. а, б, г-ж — просвечивающая электронная микроскопия; в — полутонкий срез, световая микроскопия. АГ — аппарат Гольджи, В — вакуоль, Вз — секреторная везикула, гЭПР — гранулярный эндоплазматический ретикулум, КЗ — крахмальное зерно, КС — клеточная стенка, М — митохондрия, Мж — межклетник, П — пластида, ПК — паренхиматозные клетки, ЭК — эмбриои-догенные клетки, Экз — экзоцитозное образование, Я — ядро, Ядр — ядрышко, для рис. 1—4.
клетках, вовлеченных в морфогенез, и резкое снижение его количества при инициации эм-бриоидогенеза (а также органогенеза) установлено у ряда представителей цветковых растений (Mangat et al., 1990; Yadav et al., 1999; Fortes, Pais, 2000; Martin et al., 2000; Puigderrajo
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.