ЖУРНАЛ АНАЛИТИЧЕСКОЙ ХИМИИ, 2015, том 70, № 7, с. 777-781
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 543.05:543.544.5.068.7
ОСОБЕННОСТИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЕТАЦИАНИНОВ МЕТОДОМ ОБРАЩЕННО-ФАЗОВОЙ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ © 2015 г. И. И. Саенко, В. И. Дейнека1, Л. А. Дейнека
Белгородский государственный национальный исследовательский университет, биолого-химический факультет
308015 Белгород, ул. Победы, 85 1Е-таИ: deineka@bsu.edu.ru Поступила в редакцию 29.04.2014 г., после доработки 12.09.2014 г.
Исследованы устойчивость и поведение бетацианинов свеклы в условиях обращенно-фазовой ВЭЖХ и твердофазной очистки на концентрирующих патронах ДИАПАК С18. Показано, что в кислых подвижных фазах и в растворах с рН < 4.0 деконденсация бетацианинов является основной причиной их нестабильности. Определены различия в сорбции бетанина и изобетанина при изменении рН подвижной фазы. Разработана методика твердофазной очистки бетацианинов из природных экстрактов с выходом более 90% и определения методом ВЭЖХ в режиме градиентного элюирования.
Ключевые слова: бетацианины, обращенно-фазовые сорбенты, ВЭЖХ, твердофазная очистка, де-циклизация бетацианинов.
Б01: 10.7868/80044450215070142
Среди природных водорастворимых колоран-тов наибольшее значение имеют антоцианы (Ац) и бетацианины (Бц) [1]. И хотя распространенность Ац в мировой флоре намного выше, чем Бц, окраска в большем диапазоне рН сохраняется именно у Бц [2]. Известно [3, 4], что Бц могут подвергаться нескольким типам превращений, что ограничивает сроки их хранения. Бц сохраняются в сухих формах значительно лучше, чем в растворе, а в водном растворе стабильность максимальна при рН 4.5—7.0. Ряд первичных продуктов разложения Бц, как и исходные соединения поглощают излучение в близких диапазонах электромагнитного спектра видимой области, поэтому наиболее эффективным методом контроля состава экстрактов является высокоэффективная хроматография в обращенно-фазовом режиме [5]. Высокая гидрофильность Бц требует использования элюентов с небольшими добавками органического модификатора — за пределами стабильной работы обычных стационарных фаз по отношению к коллапсу. Нами показано [6], что эффективной стационарной фазой для определения бетацианинов является Яерго8Ц-Риг С18-ЛР, причем только кислая среда (рН 2.1) обеспечивает наибольшее удерживание, что связано с особенностями их зарядового состояния.
Настоящая работа посвящена детальному исследованию условий определения бетанина и изо-бетанина методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В работе использовали хроматографическую систему Agilent 1260 Infinity с диодно-матричным детектором. Разделение осуществляли на колонке 250 х 4.0 мм Reprosil-Pur C18-AQ с подвижными фазами, содержащими муравьиную кислоту и ацетонитрил. Для приготовления элюентов с требуемым значением рН водный раствор муравьиной кислоты нейтрализовали гидроксидом натрия (контроль потенциометрический), добавляли необходимое количество ацетонитрила, фильтровали и дегазировали. Удерживание аналитов исследовали при температуре термостата колонок 30°C.
Для градиентного режима определения Бц готовили буферный раствор на основе 2%-ной муравьиной кислоты в объеме, составляющем примерно половину конечного объема, нейтрализовали гидроксидом натрия до рН 4.0 ± 0.1, делили на две равные части, в которые добавляли рассчитанные объемы ацетонитрила до концентрации 4 об. % (подвижная фаза А) и 16 об. % (подвижная фаза Б). Программа градиента: 0 мин — 0% Б, 15 мин — 100% Б, 16 мин - 0% Б и 21 мин - 0% Б.
В качестве источников Бц выбрали корнеплоды красной столовой свеклы и краснолистного амаранта. Для последующего определения методом ВЭЖХ экстракт получали настаиванием измельченного растительного материала в 0.01 М HCl, отфильтровывали через бумажный фильтр и
Таблица 1. Изменение площадей пиков бетанина и цианидин-3-глюкозида (%) при последовательном хромато-графировании одной и той же пробы с различными значениями рН
Соединение рН 1 2 3 4 5 6 7 8
Бетанин 3.05 100 100.2 99.8 99.4 99 98.6 97.9 96.7
4.01 100 99.9 99.6 99.3 99.2 98.8 98.7 98.5
4.95 100 101.2 101.1 101.0 101.2 100.5 100.6 100.0
Цианидин-3-глюкозид 2.04 100 100.1 100.0 100.1 100.1 100.3 100.4 100.5
Примечание. Интервал между вводами пробы 20—25 мин.
очищали методом твердофазной экстракции на концентрирующих патронах ДИАПАК С18. Для этого патрон активировали, пропуская 5—7 мл ацетона и кондиционировали, пропуская 10—15 мл 0.01 М HCl. Через подготовленный патрон пропускали экстракт, собирая элюат (фракция А). Затем патрон промывали 0.01 М HCl до прекращения элюирования интенсивно желтого раствора. Бц реэкстрагировали растворами, содержащими 20—30 об. % ацетонитрила с заданным рН (фракция Б). Перед хроматографированием экстракты разбавляли водой до достижения состава, не превосходящего подвижную фазу по элюирующей способности. Разбавление обязательно для исключения искажения форм пиков аналитов или появления ложных пиков.
Сорбцию на патронах ДИАПАК С18 при различных рН экстрактов осуществляли методом динамического концентрирования. Для этого получали экстракт в дистиллированной воде, доводили рН до требуемого значения добавлением HCl, получали растворы с одинаковой исходной концентрацией Бц (40 ± 5 мг/л). Экстракты пропускали через концентрирующий патрон, используя перистальтический насос (LS 301). Элюат собирали порциями по 5 мл, содержание Бц контролировали в них спектрофотометрическим методом. Степень сорбции Бц определяли по разности концентраций исходного экстракта и элюата.
Концентрации Бц определяли на спектрофотометре Shimadzu UV-2550PC (для бетанина s = = 60000 [7]).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
При хроматографировании Бц с кислым элю-ентом, предложенном в работе [6], установлено, что площади пиков довольно быстро уменьшаются при последовательном хроматографировании одного и того же образца, находившегося в закрытом крышкой флаконе в автодозаторе (табл. 1). Это уменьшение не является приборным артефактом, поскольку для антоцианов такого падения не наблюдалось. Следовательно, причиной уменьшения площадей пиков могло быть только разрушение Бц.
Известны три основных типа превращений, которым могут подвергаться Бц: обращение конден-
сации соединений I и II (реакция 1), декарбоксили-рование (реакция 2) и окисление (реакция 3) [4] (рис. 1).
Анализ изменения электронных спектров фракции А, содержащей слабо сорбирующиеся на концентрирующем патроне ДИАПАК С18 вещества, показал, что желтая окраска постепенно изменяется на красную, причем методом ВЭЖХ установлено, что в результате образуются бетанин и изобетанин (рис. 2). Логично предположить, что основной химический процесс в данном случае — реакция 1. Из двух компонентов, вступающих в конденсацию по реакции 1 (I и II, рис. 1), лишь один окрашен, причем в желтый цвет — беталамовая кислота (I). Известно, что соединение II имеет максимум поглощения при 430 нм в водном растворе [8], 405 нм в подкисленном ортофосфорной кислотой элюенте [9] или 410 нм в слабокислом элюенте неизвестной кислотности [10]. Однако исходные вещества из фракции А имели двойной максимум в диапазоне 450—490 нм, характерный для бе-таксантинов [11]. Следовательно, изменения в спектре могут быть следствием либо переконденсации беталамовой кислоты из бетаксантинов с соединением I (рис. 1), либо циклизации соответствующего нециклического продукта.
Семейство спектров фракции Б (рН 1) также имеет изобестическую точку, что свидетельствует об образовании одного продукта (или группы продуктов с одинаковым соотношением между компонентами), в электронном спектре которого максимум поглощения в кислой среде находится при 405 нм, поэтому гипотеза об обращении реакции 1 как основной причины изменения в спектрах представляется верной. Отметим, что оптическая плотность при 405 нм довольно быстро перестает расти, что может свидетельствовать о достижении равновесия в данной реакции. В действительности при длительной выдержке растворов их оптическая плотность в максимуме, характерном для Бц, продолжает медленно падать, вероятно, вследствие окисления Бц кислородом воздуха. Данные, представленные в табл. 2, подтверждают эту гипотезу. В табл. 2 сопоставлены изменения в электронных спектрах одного и того же экстракта, но разбавленного так, чтобы растворы имели примерно одинаковые начальные оптические плотности при реги-
ОСОБЕННОСТИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЕТАЦИАНИНОВ
779
HOCH,
HOCH,
-N
OH H
O
OH
HOCH2 II
HO
HO'
OH
OH H
!2
HOCH
H^^^O
O
HO
HO
OH H OH
IV
V
Рис. 1. Схема возможных превращений бетанина: I — цикло-дигидроксифенилаланин-5^-О-глюкозид, II — беталамо-вая кислота, III — бетанин, IV — 17-декарбокси-бетанин, V — необетанин.
страции спектров в кюветах с длиной оптического пути 0.1, 0.2, 0.5 и 1.0 см. По законам разбавления степень деконденсации при заданных условиях (рН и температура) должна уменьшаться с ростом концентрации Бц в растворе, что находится в полном соответствии с полученными данными.
Быстрая деконденсация бетанина проявляется и на хроматограммах, что не отражено в известных нам публикациях по данной теме. Так, при детектировании при 538 нм на хроматограмме получена обычная картина разделения бетанина и изобетанина (рис. 3, А). Однако тот же образец при детектировании при 405 нм дает характерный для разрушения одного из компонентов сигнал, начинающийся от пика бетанина, проходящий через минимум и заканчивающийся пиком беталамовой кислоты (рис. 3, Б).
Хотя стабильность бетацианинов возрастает при увеличении рН до 7 [4], исследование поведения бетацианинов в кислых растворах принципиально важно, поскольку сорбционная емкость об-ращенно-фазовых сорбентов при рН 2 значительно больше, чем при высоких значениях рН (рис. 4). Это существенно для очистки бетацианинов от сопут-
A
X, нм
Рис. 2. Спектры поглощения экстракта бетацианинов свеклы. А — фракция экстракта, не удерживаемая на концентрирующем патроне ДИАПАК С18; Б — ре-экстракт бетацианинов с патрона смесью этанол— 0.01 М HCl (1 : 1). Спектры получены с интервалами 0.5-1 ч.
Таблица 2. Изменение оптической плотност
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.